文献综述
自1928年人类发现青霉素对抗细菌，大量细菌感染性问题随着抗生素的不断发现和使用逐一被解决，人类健康医疗事业取得了质的飞跃。然而，抗生素的滥用导致了多种耐药菌的出现，极大地限制了临床微生物感染性疾病的治疗，对人类健康事业的发展带来了严重威胁。因此，寻找和研发具有高生物利用度，高活性抗耐药菌的新型抗生素迫在眉睫。
在此背景下，于本世纪初发现的硫肽类抗生素由于其对革兰氏阳性菌的超强抑菌活性[1]以及独特的作用机制给研究人员留下了深刻的印象，为众多生物合成学的研究工作者致力于阐述其合成途径为后续的开发和应用奠基。测序技术和生物信息学的飞速发展使新型抗生素的开发步入又一征途，2009年，研究人员通过基因组挖掘的方法发现了高硫青霉素和硫链丝菌肽的生物合成基因簇[2]。随后，中科院等实验室通过研究发现了它们是一类核糖体合成翻译后修饰肽(ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide,RiPP)，最初由一段结构基因编码前体肽，其中核心肽在前导肽和识别区的协助下经翻译后修饰(post-translationally modification,PTM)转化为成熟产物。RiPPs的生物合成基因簇包括前体肽基因及一系列修饰酶基因，其中脱氢酶，脱水酶，环化脱水酶，甲基转移酶基因等十分常见，所以Kelly等[3]通过 PCR 扩增前体肽基因和扩增环化脱水酶基因筛选了若干硫肽类抗生素生物合成基因簇。但硫肽类抗生素较大的分子量以及极差的水溶性给其临床药用带来了很大困难，这促使研究者不断寻找特殊的翻译后修饰酶以期得到生物利用度高的终产物。
糖基转移酶在生物体内催化活化糖基连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子，糖基化的产物与前体相比，生物学活性如水溶性，抗菌抗癌活性等往往都有所提高。而在多种多样的糖基转移酶家族中，存在一类与抗生素生物合成相关的糖基转移酶，其功能是在抗生素生物合成最后阶段糖基化中间体，通过糖基的位置、类型和数量的改变来调节抗生素的生物活性。在链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1666中[4]，抗肿瘤抗生素cytohodin X和Y分别在蒽环的C-9，C-7位经不同的糖基转移酶加尾，CytG1和CytG3实现了糖基种类和位置的特异性，CytG2则通过迭代作用完成了第二，三个糖基的并入得到三糖链。
2010年，Ding Y等[5]采取了一个新的PCR方法，通过克隆糖类N-二甲基转移酶基因首次合成了糖基化硫肽类抗生素。Bagley等[6]发现，加了糖基后的nocathiacin I 在低 pH 条件下水溶性明显升高，并在体内展现出很好的生物利用度。此外，由于选择性强、效率高、反应温和等优势,基于糖基转移酶的酶法糖基化修饰在改善天然产物成药性方面也展现出了良好的应用前景[7]。
随着对抗生素生物合成基因簇的深入探索，研究者们已经从放线菌中分离了100多个与抗生素生物合成相关的糖基转移酶基因，序列分析表明这些基因编码的蛋白都属于糖基转移酶家族[8]。参与万古霉素合成的糖基转移酶GtfB[9]具有该家族2个典型的结构特征，位于中间区域的葡萄糖结合口袋以及结合糖苷配基底物的N末端结构域表面的疏水块，从而实现了将UDP-葡萄糖的的糖基转移到万古霉素糖苷配基苯环上的4-OH上。此外，针对底物结构特异性的研究为新衍生物的发现奠定了基础[10]。
本次实验所采用的肉桂链霉菌是双环霉素的产生菌，根据整个基因组的信息，我们推测该菌株在合适的发酵条件下可以产生其他高活性的抗生素。通过生物信息学分析，我们预测了一个可能合成硫肽类抗生素的基因簇，而T825是该基因簇中的一个糖基转移酶基因。
由于框内缺失突变没有引入任何的遗传标记物，所以有效地避免了传统的基因失活方法插入重复和等位交换所导致的下游基因极性效应。本实验将针对T825这一糖基转移酶基因，采用框内缺失法构建T825敲除菌，摇瓶发酵，同步发酵培养野生型菌株，HPLC 实时监测发酵的变化，比较产物的不同，从而实现对T825功能的初步研究。其中框内缺失T825涉及同源重组质粒的构建，大肠杆菌-链霉菌属间接合转移，同源双交换阳性突变株的筛选等。
参考文献
[1] Bagley M C, Dale J W, Merritt E A, et al. Thiopeptide antibiotics[J]. Chem Rev, 2005, 105(2): 685-714.
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
