文献综述

微藻在地球生物圈中占有重要的生态地位，全球约50%的有机碳是由微藻固定，许多微藻的天然产物具有珍贵的药用价值和食用价值，一些微藻还是研究生命代谢机理的模式物种。随着人类对医药、食品、能源和环境需求的不断增加，利用基因工程手段构建新型生物反应期生产高价值天然产物的需求也不断增加，微藻因其代谢特点而成为继大肠杆菌、酵母、动植物细胞等传统生物反应器之后的又一研究热点。目前已经陆续建立了绿藻（Chlamydomonas，Dunaliella）、硅藻（Phaeodactylum trlcornutum）、甲藻（Amphidinium）、红藻（Porphyridium）、鱼腥藻（Anabaena 7120）、集球藻（Synocostys 6803）、螺旋藻（Sprilina）等微藻的外源基因转化和表达体系。其中的莱茵衣藻（Chlamydomonas Reinhartii）因其细胞结构特殊、培养容易、生长速度快、遗传学背景清晰和转化容易等原因，成为植物生物学中的一种招人喜爱的新型模式生物，具有“绿色酵母”或“光合酵母”之称。目前，人们可以将外源基因有效地转入水藻细胞核基因组中，但是转基因的表达水平一直很低。这个严重的局限妨碍了衣藻后基因组学研究以及它在分子农场中的应用。

本课题拟在莱茵衣藻S1D2中构建蛋白表达体系，利用基因筛选等方法，获得外源蛋白高水平表达的藻株。实现高效表达转基因，有可能会促进衣藻在生物制药或其他珍贵复合物领域的应用，继而引发国内外探索衣藻的热潮。

1 本课题的国内外研究现状

1.1莱茵衣藻

莱茵衣藻是隶属于绿藻门（Chlorophyta）衣藻属（Chlamydomonas）的单细胞真核微藻，细胞直径约10mu;m，紧贴原生质膜有且仅有一个大型杯状叶绿体，占细胞总体积的40%-60%，包围着细胞核；细胞顶部有两根鞭毛，侧面有一个感光作用的眼点；既能光合自养生长，又能依赖乙酸盐异氧生长；生长速度快，细胞数量倍增时间为5-6h，可在短时间内获得大量遗传后代进行遗传分析；培养条件仅要求室温（22℃）和日光灯光源（200-300mu;E m^-2 s^-1）；能在液体中静止培养或者低速水平摇动（130rpm）培养，也能在1%-2%琼脂的固体培养基上生长，并且能形成单克隆；通过调整光-暗周期，可使衣藻细胞分裂达到同步化。这些特点使得莱茵衣藻非常容易进行实验操作。更重要的是，莱茵衣藻的核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组测序工作已经完成^[8]，而且这三种基因组都可以进行转化^[9,10]。这给设计外源基因转化和表达实验带来巨大方便，更赋予了莱茵衣藻作为外源基因表达体系的新型模式物种的优势。

通过建立莱茵衣藻核转化体系，可以研究鞭毛的结构和功能^[1,2]、叶绿体功能^[3]、细胞周期和细胞-细胞交配中的相互作用^[4]。此外，衣藻兼具强大的遗传学功能和可利用的独特基因组来源；代谢产物无毒，培养成本低廉，能避免农药和环境污染，具有不同于大肠杆菌、酵母和动植物细胞载体的优势。有效核转化方法^[5]的建立，比如插入诱变^[6]和同源重组^[7]打开了衣藻技术领域的大门，使得莱茵衣藻的外源基因转化表达体系的研究受到越来越多的重视。

1.2影响衣藻转化和表达的因素

1.2.1 密码子的偏倚性

密码子的偏倚性主要影响衣藻基因组中tRNA的量，进而影响外源基因的翻译效率和表达量。衣藻核基因组具有G-C偏倚性，密码子GC占66.13%，首位碱基GC占64.65%，第二位碱基GC占47.81%，第三位碱基GC占85.94%，很明显，第三位碱基GC占比很高^[11,12]，这可能会影响不匹配密码子的序列翻译。可根据衣藻密码子偏倚性来选择密码偏倚性相近的外源基因表达或者对外源基因进行密码偏倚性改造，提高表达量。衣藻中编码绿色荧光蛋白（GFP）的合成基因的有效表达证明了该观点的正确性^[13]。

1.2.2 启动子和终止子

构建含有衣藻内源启动子和终止子的基因转化载体，对提高转化和表达效率非常重要。如在衣藻核转化过程中，来源于烟草花叶病毒的CaMV 35S和SV40启动子在衣藻中表达效率很低，基因沉默的现象也时有出现，而利用衣藻自身来源的核基因RbcS2启动子和nit1启动子可以使外源基因的表达量得到大幅度提高。选用衣藻叶绿体来源的启动子和终止子，如atpA、atpB、rbcL等基因的启动子，在启动子5rsquo;端和终止子3rsquo;端进行适当修饰，能增加mRNA的稳定性，从而提高其翻译能力，有利于外源基因的表达，且不同的启动子其控制下游基因的表达活性不同。

1.2.3 小内含子

大部分衣藻细胞核编码序列中都存在几个小内含子。尽管有几个序列里没有内含子，有内含子的序列依然在基因表达控制中扮演着重要的角色^[12,14]。因为可以通过与cDNAs转化进行诱变修复，所以内含子并不是基因表达所必备的^[15-18]。但是诱变藻株与它们各自cDNAs的互补比与它们各自基因组对应物的互补效率低。现已证明，将RbcS2基因的第一内含子插入Ble编码序列将来自RbcS2启动子的表达水平增加高达30倍。这个改善是由内含子序列中的增强因素局部导致的^[19]。人们将RbcS2启动子广泛用于驱动莱茵衣藻细胞核的基因表达，并且认为它是迄今存在的最强的组成型启动子^[20,21]。

近来，人们发现可以通过在上游插入HSP70A热休克启动子，来进一步增强RbcS2启动子的力量^[22]。但是由目的基因取代RbcS2密码序列会导致重要内含子序列的丢失和表达水平的下降。正如标记基因Ble，向密码序列中引入RbcS2内含子同样可行，但很费事。我们也可以将内含子插入没有编码的侧缘区域，但是这样做会降低它的表达效率^[19]。

1.3 转化方法

通过将DNA引入到细胞核和/或细胞器基因组中，人们成功地使转化后的生物体具备遗传能力，促进了该生物体有效的实验研究。