姜黄精油对黄曲霉的抗真菌和抗黄曲霉毒素作用机理研究外文翻译资料

姜黄精油对黄曲霉的抗真菌和抗黄曲霉毒素作用机理研究

作者：Yichen Hu ^a,b, Jinming Zhang ^c, Weijun Kong ^b, Gang Zhao ^a, Meihua Yang ^b,*

单位：a School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, PR China

b Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100193, PR China

c School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, PR China

摘要：

研究了姜黄天然精油(EO)对黄曲霉的体外抗真菌活性和体内抗黄曲霉毒素的作用机理。基于之前的气相色谱-质谱法对姜黄EO的化学表征，我们观察到姜黄EO对菌丝生长、孢子萌发和黄曲霉毒素产生具有显著的抗真菌活性，且呈剂量依赖性。此外，这些抗真菌作用与真菌细胞内膜系统(包括质膜和线粒体)的破坏有关，即麦角甾醇合成、线粒体atp酶、苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。此外，姜黄EO对黄曲霉毒素生物合成途径中霉菌毒素基因相对表达的下调揭示了其抗黄曲霉毒素的机制。最后，姜黄EO对玉米真菌污染的抑制效果表明，姜黄EO具有作为生态友好型抗真菌剂的潜力。

关键词：黄曲霉；姜黄精油；抗真菌黄曲霉毒素

1引言

产毒真菌污染所造成的经济损失和健康威胁日益严重。全世界消费的谷物中约有25%受到产毒真菌的污染(Dvegowda, Raju， amp; Swamy, 1998年)。其中，黄曲霉(Aspergillus flavus, A. flavus)是最臭名昭著的真菌种类之一，因为它干扰谷物的生物劣化和免疫抑制患者的直接感染(Cleveland et al.， 2009)。此外，黄曲霉分泌的高浓度黄曲霉毒素是天然产生的毒性最强的、可致癌的化合物，被国际癌症研究机构归类为第一类人类致癌物。黄曲霉毒素影响了发展中国家约45亿人的食品安全，黄曲霉毒素中毒在十大健康风险中排名第六(Williams et al.， 2004)。近年来，由于物理管理程序对真菌病原体的抑制作用不够，合成防腐剂被广泛应用于农作物真菌污染的防治。然而，由于耐药性显著增加(White, Marr， amp; Bowden, 1998年)、食品上的残留物对人类健康的潜在副作用(Brul amp; Coote, 1999年)以及相关真菌的污染增强(Singh等，2010年)，这些措施受到了人们广泛批评。

在此背景下，探索有效的、低毒的抗真菌药物正逐渐向天然产物转移。植物产品作为防腐剂的作用自古以来就为人所知。其中，精油(EO)被特别推荐为最有前途的抑制真菌的天然产品之一(Kalemba amp; Kunicka, 2003;Prakash, Singh, Kedia， amp; Dubey, 2012)。从各种草药或植物中提取的许多EOs表现出显著的抗真菌特性(Bakkali, Averbeck, Averbeck， amp; Idaomar, 2008;伯特,2004;Lang amp; Buchbauer, 2012)。最重要的是，大多数植物EOs表现出较高的生物安全性，被FDA归类为“一般公认的安全(GRAS)”(Kedia, Prakash, Mishra， amp; Dubey, 2014)，具有可生物降解的性质，在病原微生物中产生耐药性的风险较低(Russo et al.， 2013)。从多种姜黄植物中提取的姜黄EO的抗菌活性已经得到越来越多的证实(Apisariyakul, Vanittanakom， amp; buddhism, 1995;Jantan, Yassin, Chin, Chen， amp; Sim, 2003;Parveen, Nawaz, Siddique， amp; Shahzad, 2013;Wuthi-Udomlert, Grisanapan, Luanratana， amp; Caichompoo, 1999)。在前人研究的基础上，我们发现了国产姜黄中提取的姜黄EO对黄曲霉的熏蒸作用。然而，据我们所知，并根据文献调查，姜黄EO对黄曲霉抗真菌作用的潜在机制仍缺乏报道。因此，将姜黄EO作为一种环保型的抗真菌剂有必要进一步探索。

因此，本研究基于姜黄EO对真菌繁殖的直接接触抑制作用，测定了质膜中麦角甾醇含量的降低。此外，还研究了姜黄EO对线粒体ATP酶、线粒体脱氢酶等多种线粒体活性标志物的影响。同时，为了探索黄曲霉毒素抑制的分子机制，挖掘了黄曲霉毒素生物合成途径中一些聚类基因表达的影响。此外，我们还评估了姜黄EO作为一种抗真菌剂在模型食品系统(在培养皿中储存的玉米)中的抗菌功效，以探索提高食品储存寿命的推荐可能性。

2.材料和方法

2.1 材料

姜黄(Curcuma longa L.)的根采自中国四川省的农业农场。黄曲霉毒素标准品购自新加坡Pribolab公司，以乙腈混合溶液(AFB₁ 2 mg/mL、AFG₁ 2 mg/mL、AFB₂ 0.5 mg/mL、AFG₂ 0.5 mg/mL)配制。n-十三烷是GC-MS测定的内标(IS)，由Ehrenstorfer博士提供(德国奥格斯堡，纯度gt;99%)。实验中使用的试剂均为分析级。

2.2 真菌培养条件

黄曲霉冻干粉(CGMCC 3.4410)购自中国普通微生物培养物收藏中心(北京)。培养在Czapek Dox琼脂培养基(SCDA;(青岛霍普生物科技有限公司，青岛，中国)在恒温和湿度(分别为28℃和75%)下，12小时/12小时日光/黑暗条件下持续1周。根据我们之前的研究(Hu, Kong, Luo, Zhao， amp; Yang, 2016)，以106个孢子/ mL的密度制备黄曲霉孢子悬浮液。

2.3 姜黄EO的提取及表征

姜黄(Turmeric EO)是从中国四川省姜黄(Curcuma longa L.)根中分离得到的。根据相关分类文献和凭证标本，在北京协和医学院中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授的帮助下，对根样品进行鉴定。采用Clevenger装置对EO进行水蒸馏法提取5 h，用无水硫酸钠脱水。然后将纯化后的EO置于4 ℃的黑暗环境中进行进一步实验。根据之前报道的研究(Hu et al.， 2014)，通过气相色谱质谱(GC-MS, VARIAN, Palo Alto, USA)对姜黄EO进行了化学表征。在VF-5质谱毛细管柱上，根据与真实样品的相对保留时间和与Wiley、NIST和NBS质谱库匹配的光谱峰，以及参照脂肪烃类(C8-C22)的保留指数，鉴定出46个单体化合物。

2.4 姜黄EO对菌丝生长的抗真菌作用

姜黄EO的抗真菌活性是通过其对黄曲霉菌丝生长的接触期效应来估算的(Tian et al.， 2013)。首先将25、50、75、100、200 uL的姜黄EO分别溶于2 mL 5% (v/v) 吐温-20中。然后，这些EO悬浮液在无菌环境中移到玻璃培养皿(9times;1.5 cm)中加入23 mL的酵母提取物蔗糖肉汤(YES)培养基，以获得所需浓度的1、2、3、4和8 uL/mL。未经姜黄EO处理的样品作为对照。在每个培养板上培养10 uL黄曲霉孢子悬浮液。在28plusmn;2℃和90plusmn;2%的湿度下孵育5天后，收集菌丝，在60℃下干燥24 h，称取干重。与对照组比较，菌丝生长抑制率计算公式如下:

菌丝抑制率 = (W_c - W_s) / W_c times; 100 % (1)

其中W_c为对照皿中的平均菌丝重量，W_s为含姜黄EO的培养基中的平均菌丝重量。

2.5 姜黄EO对孢子萌发及形态的影响

根据之前发表的方法(Ferreira et al.， 2013)检测真菌孢子萌发。同样，在YES培养基中，得到一系列最终浓度为1、2、3、4和8 uL/mL的姜黄EO。随后，将黄曲霉在蒸馏水中积极培养(7 ~ 8日龄)，制备孢子的混悬液（10⁶个孢子/mL）。将50 uL分等分的孢子悬液滴涂于含或不含姜黄EO的YES培养基上。倒置显微镜下观察，当孢子萌发的芽管长度大于孢子直径时，即为孢子萌发。当对照组孢子萌发量达到总孢子量的80%以上时，将乳酚棉蓝滴入培养基中，终止孢子萌发。统计孢子萌发数和未萌发数，计算孢子萌发率。每次处理大约检查了200个单个孢子。分别在含有空白Tween-20和2 uL/mL姜黄EO的培养基中采集孢子进行形态观察。孢子用2.5%戊二醛预先在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中室温固定2小时。然后，用锇酸依次固定样品。固定后，样品在一系列分级的乙醇和乙酸异戊酯中脱水30分钟。样品在真空中干燥，用双面碳带安装在纸片上，在高真空室的溅射镀膜系统中涂上金/钯。利用JEOL JSM 5500扫描电镜在5 kV加速电压下捕捉孢子形态图像。

2.6 质膜中麦角甾醇含量的测定

黄曲霉质膜中麦角甾醇含量的测定采用之前发表的方法(Tian et al.， 2012)。将黄曲霉孢子悬液接种于含1、2、3、4和8 uL/mL姜黄EO的YES培养基，28℃，接种5 d后，收集菌丝，蒸馏水洗涤2次。为避免对质膜麦角甾醇含量的影响，菌丝体样品用滤纸吸附，而不是用烘箱烘干。每个样品中加入5 mL 25%乙醇氢氧化钾溶液，旋涡混合5 min，然后在85°C孵卵4 h。每个样品中加入2 mL无菌蒸馏水和5 mL正庚烷的混合物，提取甾醇。正庚烷层在230 ~ 300 nm范围内在紫外紫外—1700下进行扫描。麦角甾醇(282 nm)和脱氢麦角甾醇(麦角甾醇的中间体，230和282 nm)在正庚烷层中的存在导致了特征曲线。未进行EO处理的样品作为对照。麦角甾醇用量的计算公式为:

(%)/麦角甾醇 = (A282/290)/菌丝净湿重- (%)/脱氢麦角甾醇 (2)

(%)/脱氢麦角甾醇 = (A230 /518)/菌丝净湿重 (3)

其中290和518分别为结晶麦角甾醇和脱氢麦角甾醇的E值(单位为百分比/ cm)。E值是指浓度为1mol /L的样品在一定波长下，通过1cm光路的吸光度。

2.7 线粒体ATP酶和脱氢酶活性的测定

用上述方法收集经EO处理或未经EO处理的菌丝，用10 mL无菌缓冲液(含50 mM Tris (pH 7.5)、2 mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1 mM PMSF(苯基甲烷磺酰氟))洗涤2次，然后重悬于同一缓冲液中。上层清液被转移到一个新的离心管,离心5550rpm,30分钟。用2%的葡萄糖破皮获得线粒体，2000g离心5min, 5550rpm离心30min。最后将10%的线粒体重悬于缓冲液中，4℃保存至使用。

根据前面描述的方法(Tian et al.， 2012)，根据说明书，使用Micro-ATPase检测试剂盒检测姜黄EO处理真菌中的线粒体ATP酶活性。蛋白质含量按Bradford法测定，以牛血清白蛋白为标准。5 min后在636 nm处测定光密度(OD)值。然后以20 nm的无机磷酸盐作为对照。用1 mg蛋白催化1 umol无机磷反应1 h，即为1单位ATP酶活性(U/mgprot)。

此外，采用MDH活性比色法检测EO处理真菌的苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性。MDH活性比色法测定试剂盒(编号：A021-2，南京建成生物科技有限公司，中国) ，SDH活性比色法测定试剂盒(编号: A022，南京建成生物科技有限公司，中国)，分别按照说明书。1个单位的MDH活性(U/mgprot)定义为1 lmol的样品在1分钟内被该酶催化在1 mg蛋白中。1个单位的SDH活性(U/mgprot)定义为1 mg蛋白在1分钟内使OD值降低0.01。每个试验都进行了3个重复。

2.8 姜黄EO对黄曲霉毒素的抑制作用分析

Tian et al.(2011)研究了姜黄EO对黄曲霉产生黄曲霉毒素的抑制作用。将10 uL黄曲霉孢子悬液(含10⁶个孢子/mL)接种到YES培养皿中。将所需量的EO以5% (v/v) Tween-20溶液溶解于YES培养基中，最终浓度分别为2、4和8 uL/mL。未进行EO处理的组为对

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 8 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[597743]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word