寻找可持续的化学工艺：来自Clostridium absonum的7α-和 7β-羟基类固醇脱氢酶的克隆、重组表达和功能表征外文翻译资料

寻找可持续的化学工艺：来自Clostridium absonum的7alpha;-和 7beta;-羟基类固醇脱氢酶的克隆、重组表达和功能表征

作者：Erica Elisa Ferrandi amp; Giulia Maria Bertolesi amp; Fausto Polentini amp; Armando Negri amp; Sergio Riva amp; Daniela Monti

摘要：

梭状芽孢杆菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖性7alpha;-羟基类固醇脱氢酶(7alpha;-HSDH)和7beta;-羟基类固醇脱氢酶(7beta;-HSDH)通过7-酮胆酸中间体催化初级胆汁酸的异构化反应，可作为合成胆汁酸衍生物的生物催化剂。C. absonum的7alpha;-HSDH经纯化后均一，并且其N-端序列经Edman测序确定。用简并引物对基因片段进行PCR扩增后，通过测序获得了完整的基因(786nt)。通过对7alpha;-HSDH基因5′端侧翼基因组DNA区序列测定，得到了7beta;-HSDH (783 nt)的编码序列。这两个基因相邻，可能属于同一操纵子。插入合适的表达载体后，两种HSDH均在大肠杆菌中以重组形式表达，经亲和层析纯化后，在不同胆汁酸衍生物存在下进行米氏常数(K_m)和特异性常数(k_cat/K_m)的动力学分析。两种酶对所有供试底物均表现出很强的底物抑制作用。7alpha;-HSDH以鹅去氧胆酸和12-酮基脱氧胆酸为底物的KS值最低，而熊果酸是7beta;-HSDH活性的最有效抑制剂。

关键词：羟基类固醇脱氢酶；苦味梭状芽胞杆菌；胆汁酸；克隆；生化特征；底物抑制

引言

胆汁酸是重要的生物化合物，参与脂肪、脂肪酸和脂溶性维生素的消化和吸收。初级胆汁酸，包括胆酸(CA；3alpha;，7alpha;，12alpha;-三羟基-5beta;-胆碱24-油酸；方案1的1a)和鹅去氧胆酸(CDCA；3alpha;，7alpha;-二羟基-5beta;-胆碱-24-油酸；方案1中的1b)酸是由胆固醇在肝脏中合成的，在与牛磺酸或甘氨酸结合后，从肝细胞分泌到胆汁中(MukHopadhyay和Maitra 2004)。在所谓的肠肝循环过程中，即回肠末端对胆汁酸的重吸收过程中，胆汁酸被肠道厌氧菌转化成各种代谢物。修饰包括去共轭，C-3，C-7和C-12上羟基的氧化/还原，羟基的异构化和7alpha;/beta;的脱羟基，并导致所谓的次生胆汁酸的生物合成(Ridlon et al. 2006年；Prahba and Ohri 2006)。后一种化合物的兴趣不仅在于理解其生物学功能，而且在于其药理应用。熊去氧胆酸(UDCA；3alpha;,7beta;-二羟基-5beta;-胆酸-24-油酸，3b)已广泛用于治疗各种肝病，如原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎，以及胆固醇结石溶解治疗(Beuers 2005)。此外，最近的研究表明，不同的次级胆汁酸可以通过激活肝脏和胃肠道细胞中特定的核受体和细胞信号通路作为激素(Thomas等人.2008年；Hylemon等人.2009年)。因此，目前正在研究半合成胆酸衍生物作为治疗肥胖症和糖尿病等重要代谢性疾病的药物(Pellicciari等人.2009年)。

在这种背景下，为了解决胆汁酸结构的复杂性，有效的合成工具的可用性是至关重要的，以立体和区域选择性的修饰初级胆汁酸为其衍生物。通过分离的酶催化反应对胆汁酸的生物催化转化进行了广泛的研究(Fossati和Riva 2006年)，但由于缺乏商业上可获得的生物催化剂，限制了研究反应的规模扩大到工业水平。

羟基类固醇脱氢酶(HSDHs)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性酶，属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族(Kavanagh等人)。2008年)。它们催化中性类固醇、胆汁酸和其他类固醇衍生物的羟基氧化/还原，并被广泛用于它们的选择性修饰(Fossati等人)。2006年；Kristan等人。2007年；Pedrini等人。2006年；Monti等人。2009年)。

具体地说，7alpha;-HSDHs (EC 1.1.1.159)和7beta;-HSDHs (EC 1.1.1.201)可用于初级胆汁酸C-7位羟基的选择性alpha;/beta;转化(方案1)，这是目前在工业水平上通过多步化学过程(Iida和Chang 1982)实现的。在许多肠道细菌中都检测到了这两种酶的活性(Leercq等人。2004年)。目前已经从大肠杆菌(Yoshimoto et al. 1991)、脆弱拟杆菌(Bennett et al.2003)、sordellii梭菌(Coleman et al. 1994)和ubacterium sp. (Baron et al. 1991)菌株中克隆了7alpha;-HSDHs的编码基因。此外，还测定了大肠杆菌7alpha;-HSDH的晶体结构(Tanaka et al.。1996年)，并研究了活性位点残基在催化和辅助因子识别中的作用(Tanabe等人)。1998年)。相反，关于7beta;-HSDHs的信息较少，显示这种活性的酶已经从瘤胃球菌中(Akao et al.。1987)和消化性链球菌产品中纯化(Edenhard et al.。(1989年)得到部分纯化。最近，从Collinsella(原真细菌)Aerofaciens中鉴定并克隆了依赖于NADPH的7beta;-HSDH基因(Liu etal. 2010),序列分析表明，该基因与细菌7alpha;-HSDH的相似性较低，而与哺乳动物的11beta;-HSDH有较近的亲缘关系。

第一批同时产生7种alpha;和7种beta;-hSDH活性的细菌之一是苦味梭菌，一种类似产气荚膜菌的细菌(Macdonald等人。(1981年)。酶的表达不是组成的，而是由培养基中添加初级胆汁酸诱导的(Macdonald and Roach 1981;Macdonald and Sutherland 1983)。根据Macdonald的方案(Macdonald et al. 1983)制备的这些酶的部分纯化样品，已经被用来探索各种胆汁酸衍生物的立体和区域选择性氧化/还原(Riva等人。1986年；B o v a r a e t a l.。1993,1996；M o n t i e a l.。2009年)。

在本研究中，我们克隆并表达了来自 C. absonum 的 7alpha;- 和 7beta;-HSDH（分别为 Ca7alpha;-HSDH 和 Ca7beta;-HSDH）。此外，重组酶在工业上用于合成胆汁酸衍生物的氧化还原反应中已被提交详细的动力学和功能表征。

材料和方法

细菌菌株和材料

C. absonum DSM 599 (ATCC 27555)来自DSMZ(德国微生物和生物制品公司)。大肠杆菌TOP10 [F-mcrA Delta;(mrr-hsdRMS-mcrBC) Phi;80lacZDelta;M15 Delta;lacX74 recA1 araD139 Delta;(araleu) 7697 galU galK rpsL ( S t r R ) endA1 nupG]购自德国达姆施塔特公司。脑心输液(BHI)培养基和熟肉汤来自Oxoid(英国汉普郡)。胰蛋白胨和酵母膏来自西格玛奥德里奇（(美国圣路易斯)。胆酸、鹅去氧胆酸及其衍生物来自Prodotti Chimici e Alimentari S.p.A.(巴萨卢佐，意大利)。所有其他试剂都是分析级的且可商购。

C. absonum DSM 599依赖NADPH的7alpha;-HSDH(CA7alpha;-HSDH)的表达和纯化

C. absonum DSM 599在37°C的熟肉肉汤中和厌氧条件下过夜生长后，保存在minus;80°C。将1ml发酵剂接种到无菌BHI培养基(3times;100mL)中，反复进行真空-氮气循环除氧。在37°C的氮气下过夜生长后，在每个培养体中加入900 mL新鲜BHI培养基，保持相同的条件。在OD₆₀₀=0.4,将鹅去氧胆酸加入到终浓度为0.4 mM的培养基中，继续培养2.5 h。离心(3,000times;g，4°C，30min)，再悬浮于5 0mL裂解缓冲液(2 0mM磷酸二氢钾缓冲液，pH8.0，1mDTT，含10 0mu;L Lminus;1蛋白酶抑制剂)中。超声细胞破碎机超声裂解后(Omni Ruptor 250W(美国Kennesaw)，60%占空比，三次超声，每次30s)，离心除去细胞碎片。上清液透析至20 mM KP缓冲液，pH8.0，1mMEDTA，1mMDTT，5%(v/v)甘油( 缓冲液A）并装载到Fractogel EMD DEAE-650(S)(默克)柱(16times;110 mm)，先用缓冲液A(1mL^minus;1流速)平衡。用5个体积的缓冲液A洗涤后，在同一缓冲液中以0~0.25M的线性梯度洗脱结合蛋白4h，在280 nm处连续监测蛋白浓度。收集含有7alpha;-HSDH活性的组分，直接应用于预先用含有0.1MNaCl的缓冲液A平衡的活性红120^TM3000CL(Sigma-Aldrich)柱(10times;100 mm)。用平衡缓冲液洗涤色谱柱后，在相同缓冲液中用0.1至1 M NaCl线性梯度洗脱7alpha;-HSDH活性，以1mL^minus;1流速在2h内洗脱。收集活性组分并通过超滤浓缩至最终体积240mu;L。进一步的纯化采用反相高效液相色谱(HPLC)，柱为Jupiter 300Ǻ C₄ (Phenomenex, Torrance, USA)，流动相为3% (v/v) CH₃CN和0.1% (v/v)三氟乙酸(TFA)在去离子水中平衡(缓冲液B，流速:1 mL min^minus;1)。加载后，用缓冲液B和70%(v/v)CH3CN、0.1%(v/v)TFA在水(缓冲液C)中的混合物洗脱蛋白质，按以下梯度洗脱：T=0min，缓冲液B/缓冲液C=90/10；T=2min，缓冲液B/缓冲液C=50/50；T=30min，缓冲液B/缓冲液C=28/72；T=40min，缓冲液B/缓冲液C=0/100。收集蛋白质组分，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-P-AGE)进行检测。

Ca7alpha;-HSDH N端氨基酸序列的测定

Ca7alpha;-HSDH的N端氨基酸序列是在SDS-PAGE后，使用Applied BioSystems Procise 491测序仪通过自动Edman降解在聚偏二氟乙烯膜上电印迹的蛋白质（美国Billerica Millipore的Immobilion-P）上进行的。

普通分子生物学技术

使用来自Macherey-Nagel (Duuml;ren，德国)的NucleoBondreg;AXG 100柱和NucleoBondreg;Buffer set III纯化基因组DNA。用QIAprep Spin Miniprep Kit或HiSpeed质粒Midi Kit(德国希尔登)提纯质粒DNA。DNA测序由Bio-Fab Research(意大利罗马)进行。将基因片段亚克隆到pJet1.2中。载体用CloneJETtrade;PCR克隆试剂盒(德国圣莱昂罗特费伦塔斯)进行。所有的DNA消化都是使用来自Fermentas的限制性内切酶并根据他们的建议进行的。根据Sambrook等人的方法，用质粒DNA转化大肠杆菌。(2001年)。如无特殊说明，标准PCR条件为：95°C保温2min，然后95°C保温30s，46°C保温30s，72°C保温1min，然后72°C保温10min。

C. absonum DSM 599 Ca7alpha;-HSDH和NADPH依赖型的7beta;-HSDH基因的克隆(Ca7beta;-hsdh)

根据实验测定的CA7HSDH的N-末端序列和来自不同菌株的其他7个alpha;-HSDH的保守序列(详见Appl Microbiol Biotechnol(2012)95：1221-12331223)，设计了一组简并引物(附录Material for Appl Microbiol Biotechnol(2012)95：1221-12331223)。使用XtraTaq Pol试剂盒(Genespin，米兰，意大利)，在50-mu;L体积中进行简并PCR，扩增程序为：95°C 3min，然后在95°C下循环50次，30s，35°C，30s，72°C，1min，然后72°C，10min。引物F6(5lsquo;-GGCTWGARGGNAARGTDGCNATHGT-3rsquo;)和R2(5lsquo;-GGGTTRTTHACWARDATRTCDA T-3rsquo;)扩增出269bp的产物，并将其亚克隆到pJet1.2载体(发酵菌)中并测序。按照Triglia等人描述的方法进行反向PCR(1988)。用Bsp143I限制性内切酶在37℃、总体积30mu;L的条件下，用酶供应商(酵母菌)推荐的缓冲液对16mu;g的C. absonum基因组DNA进行酶切过夜。经热处理(65°C 20分钟)使核酸内切酶失活后，在连接缓冲液(50mMTris/HCl，pH7.5，10 mMMgCl2，10 mM二硫苏糖醇，1 mM ATP，25mu;g m L^minus;1牛血清白蛋白，最终体积16mL)中稀释至1 ng/HCl的最终浓度，在16℃下与80U的T4DNA连接酶(Genespin)孵育过夜。用乙醇沉淀法回收连接的DNA片段，再悬浮在150mu;L的H2O中，作为反向聚合酶链反应模板。扩增50mu;L反应混合物包括环状mu;(5-30mu;L)、F14(5lsquo;-AAGCTGAAGGCAGGA TAGA-3rsquo;)和n d R 1 9(5lsquo;-A TTGCGACTTTACCCTA-3rsquo;)引物(各100 ng/mu;L)、dNTPs(各0.2 mm)、2U XtraTaq Pol和5 UXtraTaq缓冲液(均来自Genespin)。PCR反应条件为：95°C保温3min，95°C保温30s，46°C保温30s，70°C保温3min，72°C保温10min，共45个循环。将扩增产物(2

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