UHPLC-MS/MS法测定中药制剂的活性成分及其临床前应用 纯麻黄碱、麻黄单- -植物提取物和多种植物制剂在大鼠体内的药代动力学外文翻译资料

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UHPLC-MS/MS法测定中药制剂的活性成分及其临床前应用

纯麻黄碱、麻黄单一植物提取物和多种植物制剂在大鼠体内的药代动力学

王汝文a，蒋梦轩a，吕家明a，蔡冬胡a,b,c,d

a国立阳明大学传统医学研究所，台湾台北

b中国医科大学针灸研究所，台湾台中

c高雄医科大学药学院药学院，台湾高雄

d教育系研究，台北市立医院，台湾台北

摘要

草药制剂“麻杏甘石汤”（MXGST）是一种流行的中药配方，已被用于治疗咳嗽和发烧。MXGST的潜在活性成分是麻黄碱、苦杏仁苷和甘草酸。这项研究的目的是开发一种经过验证的分析方法，以使用超液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS / MS）测定草药制剂MXGST中的这些分析物。多反应监测（MRM）用于监测麻黄碱（[M H] ）的m / z 166.1→148.1，苦杏仁苷（[M NH4] ）的475.2→163.0，840.6 →（[M NH4] ）表示甘草酸。 用反相C18色谱柱（100times;2.1 mm，2.6 micro;m）分离分析物。流动相由5 mM乙酸铵（0.1％甲酸）和100％甲醇 （0.1％甲酸）组成，采用线性梯度洗脱。分析了五个品牌的商业药用草药产品和MXGST的实验室提取物。 此外，采用改良后的UHPLC-MS / MS方法对以下三种来源的麻黄素在大鼠体内的药动学进行了比较：（1）纯麻黄碱，（2）麻黄的草药提取物（3）MXGST的草药制剂。通过蛋白沉淀，蒸发和重构来制备来自大鼠的血浆样品。药代动力学数据表明，纯麻黄碱的吸收速度明显快于麻黄提取物或MXGST草药制剂中的麻黄碱。 然而，作为纯化合物服用的麻黄碱的消除半衰期为93.9plusmn;8.07分钟，但对于麻黄提取物和MXGST中的麻黄碱，其半衰期分别为133plusmn;17和247plusmn;57.6分钟。浓度曲线下的面积（AUC）在三组之间没有显示出显着差异。这些数据表明，麻黄提取物和MXGST中的其余草药成分可能提供补偿作用，降低麻黄碱的峰值浓度并延长消除半衰期。

1. 介绍

麻杏甘石汤（MXGST）由麻黄，杏仁，甘草和石膏组成（麻黄，杏仁，甘草和石膏的比重为4：3：2：8）。该制剂是一种流行的中药配方，用于治疗“热邪充肺”，就是西医上的治疗咳嗽，哮喘和发烧。根据台湾厚生省中医药部发布的指导方针和2000年前（公元150-219年）张仲景撰写的著名医经典《伤寒论》可知， MXGST是治疗咳嗽和发烧的基本中药配方。即使在现在，MXGST在临床应用中还是一种流行的中药。根据台湾国家健康保险研究数据库的调查，MXGST是用于治疗人气喘病排名第三的最常见中药^[1]。 也是台湾哮喘儿童最常使用的^[2]。 MXGST不仅为台湾和中国的从业者所熟悉，而且在汉方医学中也得到了应用。它在日本被称为Makyo-kanseki-to。

因为MXGST被指定用于呼吸系统疾病，所以药理学研究集中在其抗炎，抗病毒和支气管扩张特性上。一项研究表明，MXGST抑制了抗原诱导的豚鼠立即哮喘反应，并抑制了中性粒细胞浸入肺组织^[3]。MXGST的抗病毒活性与TLR3-IRF3-IFN-信号通路的抑制和SOCS1的表达有关，以减少RSV感染小鼠的肺部炎症并抑制病毒复制^[4]。MXGST各药的药理作用也与呼吸生理有关。麻黄（中麻黄）已在中药中使用了五千年，但由于其活性生物碱麻黄碱而在1920年代初成为一种著名的草药。麻黄碱是一种有效的支气管扩张剂，在alpha;-和beta;-肾上腺素能受体理论的发展中起着重要作用^[5]。杏仁因抑制Th2细胞反应而具有抗哮喘活性^[6]。苦杏仁苷是一种生氰糖苷，是苦杏仁的主要化合物之一。甘草，一种常见的中草药，常用于哮喘患者^[1]。 甘草的甜味来源于甘草酸，它是一种三萜类化合物^[7]。 根据最近的一项研究，三萜酸可以通过减轻细胞凋亡和抑制炎症来保护支气管上皮细胞^[8]。最近，台湾的许多中医开始倾向于开药方药而不是传统汤剂，因为药方药对患者方便，并且是由cGMP制药厂生产的，这将监控干药材来源源，重金属，农药残留等。商业药用草药产品通过工业方法生产，包括水煎，提取，浓缩和包装^[9]。 由于制药行业的制造过程因工厂而异，因此活性化合物浓度可能会有所不同^[10]。 因此，重要的是确定每种MXGST商业药用草药产品中的活性化合物。

中医组合原则遵循君、臣、佐、使原则的基本理论。该理论表明，君药物用于治疗疾病，臣佐药物和辅助药物支持主权，而使药物则提供了到达人体目标部位的有效原理。因此，我们主要对MXGST中主要草药麻黄的药代动力学感兴趣。草药制剂中的主要草药通常直接治疗主要综合症。高效液相色谱-串联质谱（UHPLC–MS / MS）分析为研究药物代谢和药代动力学筛选提供了一种快速而精确的方法^[11]。麻黄是一种常见的中草药，并且已经开发了HPLC方法来分析麻黄中的生物碱以鉴定大鼠的药理学和药代动力学^[12–14]。此外，还比较了麻黄-苦杏仁草药对汤剂的药代动力学与单独草药的药代动力学^[15]。但是，目前尚无纯麻黄碱，单一草药麻黄提取物和MXGST草药制剂的药代动力学比较。

由于尚未对MXGST中的三种主要活性化合物进行仔细的分析，也未对三种麻黄碱制剂的药代动力学进行比较，因此，研究的目的是开发和验证使用UHPLC-MS / MS的特异性和灵敏的分析方法评估实验室提取物和五个制药工业产品品牌。此外，我们建立了一个自由运动的大鼠模型，以比较（1）纯麻黄碱，（2）麻黄的草药提取物和（3）MXGST的多种草药制剂。

2. 材料与方法

2.1. 试剂和材料

标准成分如下：盐酸麻黄碱，苦杏仁苷，甘草酸铵盐，卡维地洛（内标）和肝素由Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。戊巴比妥钠购自SCI Pharmatech，Inc.（台湾Toayuan）。E.Merck（德国达姆施塔特）提供了所有化学溶剂，包括HPLC级的甲醇，甲酸，氯化钠和乙酸铵。在整个实验中使用的三重去离子水由Millipore（美国马萨诸塞州贝德福德）纯化。五个品牌的MXGST商业药用草药产品分别从台湾台北的Sun Ten Pharmaceutical Co.，Ltd.，创松宗制药Co.，Ltd，Kaiser Pharmaceutical Co.，Ltd.（台湾台南），（台湾高雄），盛昌制药有限公司（台湾台北）和 Koda Pharmaceutical Co. ， Ltd. （ 台湾 台 北 ）购买 。 药 品 购 自 Koda Pharmaceutical Co.，Ltd.（台湾Taoyung）。

2.2. 准备库存和校准标准

在100％甲醇中制备麻黄碱，苦杏仁苷，甘草酸和卡维地洛的标准储备溶液（1 mg / mL）。将工作标准溶液从储备溶液中以50％甲醇（v / v）稀释，浓度为250–10,000 ng / mL。从工作标准溶液（30 micro;L）分别以25、50、100、250、500和1000 ng / mL的浓度以及270 micro;L的卡维地洛的内标溶液（5 ng / mL）制备用于量化实验室提取物和市售草药产品成分的校准曲线。

为了测量分析物的生物学样品，将一系列工作标准溶液加标到空白的无药血浆中，以产生50、75、100、250和500 ng / mL的浓度。所有标准溶液在使用前将储存在-20◦C中。

2.3. 传统MXGST的制备

根据介绍中提供的信息，麻黄，杏仁，甘草和石膏的重量比为4： 3：2：8。压碎的草药由台湾台北的一家中草药商店提供，并通过与文献数据比较而得到证实^[16]。 沸腾提取的方法基于“伤寒论”。首先，将160 g麻黄与1.4 L水煮沸，直到水降至1.2L。然后，添加45 g杏仁，30 g甘草和120 g石膏。将汤煮沸，直到水降至0.6 L，然后通过纱布过滤。将滤液浓缩至0.1L，并在80◦C下保存一天以进行冻干。采用MXGST提取物的冻干粉进行定量。

五个品牌的MXGST商业药用草药产品的粉末被随机标记为A至E，实验室提取物的标记为S。小心称量每种制备物0.1克的样品。将每种粉末悬浮在25 mL的100％甲醇中，并在室温下超声15分钟。在此步骤中，不会用有机溶剂（甲醇）萃取石膏CaSO4，并且不认为钙，非挥发性盐，会引起源腐蚀。将样品在4◦C下以13,000 rpm离心10分钟。收集上清液并通过0.22mu;m过滤器过滤。最后，滤液用卡维地洛（5 ng / mL）稀释200倍，并转移到进样量为5 micro;L的自动进样器中进行分析。

2.4. UHPLC–MS / MS条件

色谱泵与LC-20AD UHPLC系统（日本京都府岛津市）相连，该系统包括系统控制器，脱气器，自动进样器，柱温箱和两个泵。使用反相 Kinetex C18 色谱柱（ 100 2.1 mm ， 2.6 micro;m ；Phenomenex，Torrance，美国）和保护柱（Phenomenex AF0-8497，Torrance，美国）在35◦C的温度下分离所有分析物。流动相由5 mM乙酸铵（0.1％甲酸）作为水相（A）和100％甲醇（0.1％甲酸）作为有机相（B）组成，并进行线性梯度洗脱。梯度程序如下：0 –1分钟时B–20–70％B，1–4分钟时B–70–90％B，4–9分钟时90％B，90–20％B 9–10分钟，20％ B在10-13分钟。流量设置为0.2 mL /分钟自动进样器的温度设置为8◦C。UHPLC-MS / MS系统包括一台LCMS-8030三重四极杆质谱仪（日本京都市岛津市），在正离子模式下配有电喷雾电离界面。以下是典型的离子源参数：分别以3 L / min和15 L / min流动的雾化气体和干燥气体（均为氮气）；碰撞气体，氩气，压力为230 kPa。界面电压为3.8 kV，去溶剂化线（DL）温度为250◦C，加热块温度为400◦C。检测设置离子数用于多反应监测（MRM）。

2.5. UHPLC–MS / MS方法验证生物样品

方法验证是根据美国食品药品监督管理局（FDA）提出的用于生物分析方法验证的准则进行的^[17]。 评估方法的线性，准确性，精密度，定量下限（LLOQ），基质效应，回收率和稳定性。

2.5.1. 线性，精度和精密度

由麻黄碱，苦杏仁苷，甘草酸和卡维地洛的峰面积比计算出校正曲线。每个校准曲线的线性由至少0.995的相关系数（r²）定义。从线性回归方程计算出三种活性化合物的未知样品浓度。每个验证运行都包含六种标定浓度为25–1000 ng / mL的校准标准品，用于定量实验室提取物和商业药用草药产品。大鼠血浆的验证校准范围是50–500 ng / mL。加标方法与“备料和校准标准品”部分中所述相同。通过在一天（一天之内）和连续六天（一天之内）内重复六次校准曲线来评估准确性和精密度。精度和精确度计算为精度（偏差，％）= [（C肥胖–C名）/ C名]times;100％，精度（相对标准偏差，RSD，％）= [标准偏差（SD）/ C肥胖]分别为100％。除LLOQ差异高达20％外，准确性和精度值的变化范围在15％以内。检测限（LOD）定义为s / n（信噪比）gt; 3的最低浓度，定量下限（LLOQ）s / ngt; 10的最低浓度。

2.5.2. 基质效应与恢复

用三种方法对基质效应和回收率进行了测试，以评估定量生物分析方法。在低，中和高QC浓度（50、100、500 ng / mL）下测定麻黄碱，而卡维地洛在10 ng / mL下进行测定。这三套如下：

设置1。标准溶液。向各种浓度的标准溶液（10 micro;L）中加入90 micro;L流动相（50％甲醇 0.1％甲酸）。混合后，将溶液转移到自动进样器中，然后注入UHPLC-MS / MS系统。

设置2。提取后刺入。提取后加标溶液。将空白（无药物）血浆添加到两个体积的乙腈中进行蛋白沉淀，其过程与样品制备相同。重构干残留物后，将90 micro;L基质溶液与各种浓度的标准溶液（10 micro;L）混合。混合物通过0.22 micro;m过滤器过滤，转移到自动进样器中，并注入UHPLC-MS / MS中。

设置3。提取前加标。萃取前将标准溶液加标。在空白血浆（90 micro;L）中加入各种浓度的标准溶液（10 micro;L）。以下过程与样品制备相同。溶液蒸发并复溶后，通过0.22 micro;m过滤器，转移到自动进样器中，然后注入UHPLC-MS / MS中进行分析。通过比较这三组的峰面积，可对基质效应（％）和回收率（％）值进行如下评估：分别为Set 2 / Set 1times;100和Set 3 / Set 2times;100。

2.5.3. 麻黄碱在大鼠血浆中的稳定性

麻黄碱在大鼠血浆中的稳定性通过QC浓度（50、100、500 ng / mL）进行测量。在以下条件下评估了稳定性：冻融，短期，长期和自动进样器存储。从暴露于20◦C的三个循环中24小时的QC样品中测定冻融稳定性，室温下融化，然后再次冷冻至少12 h。通过将QC样品保存3小时以监测麻黄碱在治疗过程中的稳定性来测量短期稳定性。长期稳定性是由在-20◦C下储存28天的QC样品确定的。通过在自动采样器中于8◦C下保持12 h的QC样品评估自动采样器的稳定性。将所有QC稳定性样品中的5％与新鲜制备的QC样品通过以下公式进行比较：稳定性（％）=（C_obs/ C_nom）times;100。

2.6. 实验动物

该研究严格遵守国立阳明大学实验动物护理指南和程序。从国立阳明大学实验动物中心获得了雄性无致病性的Sprague-Dawley大鼠（230plusmn;30g）。在口服测试物质8小时之前和4小时之后

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