通过X射线微型电脑断层扫描（micro-CT）演示活裸鼠中实验性肺转移和骨转移外文翻译资料

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通过X射线微型电脑断层扫描（micro-CT）演示活裸鼠中实验性肺转移和骨转移

本研究的目的是评估微型电脑断层扫描（micro-CT）用于裸鼠肺转移和骨转移的检测和监测的实用性。在深部麻醉下对肺转移或骨转移的裸鼠进行全身微型CT扫描。通过微型微型CT估计单个肺转移的体积，并与切除的肿瘤进行比较。结果是两个数据集高度相关（p lt;0.0001）。检测到的最小肺肿瘤直径为0.85毫米。通过对活体小鼠进行长期的的微型CT扫描得到了对转移性肺部疾病，包括肿瘤生长和胸腔积液，研究的进展。此外，通过微型CT成功检测到了多个具有溶骨性和成骨细胞特征的骨转移。通过组织病理学检查证实转移灶是由微型CT识别出的骨损伤。 在检测和监测裸鼠的实验性骨和肺转移实验中，Micro-CT可用作准确的，无伤害的工具。

关键词：微计算机断层扫描；X-射线；肺转移；骨转移；和裸鼠

介绍

模仿骨骼和肺中转移性疾病发展的啮齿动物模型越来越多地被认为是抗癌药物开发中的有力工具，用于评价新药在临床的功效。与可以直接测量肿瘤大小的皮下移植物不同，活体动物中骨和肺中转移性疾病的检测和监测仍然是一个挑战。对于骨转移，观察肿瘤生长所引起的症状可用于推断疾病进展（1）。然而，这种方法不能用于提供个体肿瘤灶的生长的定量评估，也不能用于对治疗的反应。在肺转移的情况下，观察疾病的发展和解剖位置通常需要杀死动物。

近年来，商业化的高分辨率微型计算机断层扫描（micro-CT）成像系统已经可用于对小型实验室动物（2,3）进行成像。在理论上，微型CT扫描仪可以提供优良的具有高对比度的组织（即骨和肺）中肿瘤图像。微型CT已广泛用于研究活体动物的骨骼结构[参考文献（2）]。然而尚未用于检测啮齿动物中的骨转移。尽管De Clerck等人 最近证明了微型CT检测肺结节的可行性（4），在该技术可用于监测肺肿瘤生长之前，需要验证微型CT是否能够检测的肿瘤大小。

在本研究中，我们使用非呼吸门控微型CT对裸小鼠骨和肺的实验转移瘤模型进行成像。通过将人源肿瘤细胞悬浮液注入心脏左心室来模拟骨转移（5）。通过静脉注射肿瘤细胞产生“转移性肺部疾病”。研究的目的是评估微型CT用于检测实验性骨和肺转移性疾病的效用以及连续成像用以定量监测肺肿瘤进展的效果。

材料和方法

肿瘤模型

根据纪念斯隆凯特林癌症中心的指导方针使用裸鼠。实验方案由动物护理机构和使用委员会批准。所有实验使用6-8周龄雌性无胸腺NCr-nu / nu小鼠（NCI-Frederick Cancer Research Institute）进行。接种肿瘤细胞时动物的平均重量约为20g。在进行最终的微型CT扫描后，动物会被二氧化碳窒息安乐死。

小鼠肿瘤FSa-II细胞系衍生自自发性小鼠纤维肉瘤引起的第四代肿瘤（6）。从ATCC（Manassas，VA）获得人的非小细胞肺腺癌细胞系A549。通常情况下，将细胞培育在有10％胎牛血清，1％谷氨酰胺和1％谷氨酰胺的McCoys 5A改良培养基（Invitrogen，Grand Island，NY）和Kaighn修饰的Hams F12培养基（Cellgro，Herndon，VA）上。

为了模拟肺转移，将FSa-II细胞（从5times;103到3times;104的0.1ml PBS）注射到小鼠的侧尾静脉。这产生了几个肺部病灶，“致病”率约为100％。 随后，小鼠在注射后继续养五周。

为了模拟骨转移，将A549细胞（0.1ml PBS中的1times;10 6）注射到麻醉动物的心脏左心室中。简而言之，通过将26G3 / 8针（连接到1ml注射器）插入位于第三肋间处的胸骨左边缘1mm处，并且将红色血液快速地注射到小鼠体内， 注射过程中的针头的状态是注射成功的标志。致病（XFL）的成功率超过90％。在五只裸鼠注射左心室成功7周后进行全身微型CT扫描。

隔夜禁食后，通过吸入1.5％异氟烷在碳酮（Tech Air，95％氧气和5％二氧化碳，气流：1-2L / min）的混合物将动物麻醉。将动物置于扫描器平台上，连续吸入异氟烷以维持麻醉。观察到小鼠的呼吸和心跳显着下降，表明已经进入深度麻醉。在以前的小鼠研究中已经观察到异氟烷对呼吸速率降低和振幅混合变化的影响（7）。

使用MicroCAT-II TM扫描仪（ImTek，Knoxville，TN）获得CT图像。X射线管电压固定在55kVp，电流为800mu;A。microCAT IItrade;检测器是通过光纤锥度耦合到高分辨率荧光屏的热电冷却充电耦合检测器（CCD）阵列。它的像素大小为（0.092mm）²。MicroCAT-IItrade;的标称空间分辨率为0.1 mm。横向视野直径为35mm，可容纳小鼠或小型的（约100g）大鼠; 纵向视野为70mm，并且可以在单次采集（即，x射线和检测器组件的全旋转）中提供全身图像或部分大鼠图像。以1ordm;步进进行360°（一转）微型CT采集。每个投影图像的持续时间约为0.75秒，完成旋转图像采集需要约12分钟。没有使用呼吸门控。除非另有说明，通常不使用造影剂进行微型CT扫描。MicroCAT-IItrade;的图像数据使用超快速体积重建引擎（实时图像重构系统）进行处理，使得重建能够与图像采集并行进行。使用在[多图像分析实用程序（MIAU）（8,9）]中开发的软件或商业购买的Amira数据可视化软件（版本3.1，TGS，San Diego）]显示重建的图像。全身断层摄影图像与骨骼投影视图[冠状面最大投影（MIP）]和旋转图像一起生成。肺焦点通常使用横断层图像进行可视化，根据需要使用冠状面和矢状面断层图像。多重可视化技术是检测骨病变的最佳方法。微型CT图像通常由两位作者（XFL和PZ）在不知道病理记录的情况下阅读微型CT图像，并根据以前的正常非肿瘤组织微型CT成像经验进行了解释。当发生分歧时，第三作者（JOD）做出了最终判断。通过对比微型CT成像数据对肺肿瘤进展进行估计和监测。

使用不同程度的转移性肺部疾病的10只裸鼠，用MIAU方法评估CT-预测的肺肿瘤体积的准确性。CT估计的肿瘤体积的方式是基于将肿瘤建模为椭圆体来估计肿瘤体积的标准临床方法。先确定肿瘤的三个主要轴a，b和c，然后计算相应椭圆体的体积（4pi;/ 3）（a / 2）（b / 2）（c / 2）=（pi;/ 6）abc。

在图像采集之后，杀死动物，并通过数字摄影记录在切下来的肺中的肿瘤（通常在肺表面上）的位置。使用镊子将肿瘤与肺分离。肺组织粘连少; 在称重之前，通过将纸巾上的肿瘤印迹来除去潜在的粘附性渗出物。肺结节的直径范围从几百微米到几毫米。对于较小的肿瘤，肿瘤重量可能需要使用比计算法或排水法更可靠的体积计算方法。该方法已经用于其他地方的微型CT研究中的肿瘤体积的计算（11）。

在另外一组小鼠（n = 4）中，在注射3times;104个FSa-II细胞后5,11,18,21和25天使用微型CT持续观察肺部疾病的进展。在进行最终的微型CT扫描后杀死动物，如上所述记录大体解剖结果。

对比介质用于检测肺转移酶的实用性

在4周前接种FSa-II细胞的另外一组动物（n = 5）中，使用长效血液池造影剂Fenestra VC（Alerion Biomedical，Inc）试图改善肺分化 胸部正常血池结构的肿瘤结节（血管和心脏）。Fenestra VC通过侧尾静脉以30-60秒的时间以0.4ml的剂量施用，立即进行微创CT扫描（非对比CT）和注射后1小时（对比度CT）。

组织学分析

在动物处死后，通过用0.5ml中性缓冲的10％福尔马林将气管注入肺部来充气。

将肺和心脏切除放在一起，并在10％福尔马林中固定，然后包埋在石蜡中并定向，从而可以获得横截面。解剖的肺结节也固定并安装在石蜡块中。将小鼠体固定在10％福尔马林中，切除骨骼肌骨骼，通过浸入Surgipath II脱钙溶液（10％甲醛，8％甲酸，1％甲醇; Surgipath，Richmond，IL）中约24小时进行脱钙，随后 嵌入石蜡并定向。对整个小鼠的肺部每隔0.5mm切片（7mu;m切片），或对整个骨骼进行切片，每片0.1mm。 还对解剖的肺肿瘤块切片，并获得含有肿瘤的数个7mu;m厚的切片。切片用苏木精和伊红（H＆E）染色。切片分析由经验丰富的病理学家Krista博士（Dr. Krista M.D.）进行。纪念斯隆凯特林癌症中心。

结果

正常肺微型CT图像

图1A显示了在平均水平的无病成年雌性裸鼠的胸部的横向微型CT图像。正常肺组织具有低密度和相应较低的CT数，支气管的内腔CT值最低（CT图像为孔）。显示高X射线吸收的肺内血管和相应的高CT数优先分布于肝门区域，这是对区分异常的重要性的观察。

转移酶的微型CT

肺肿瘤微型CT图像

具有肺转移的小鼠胸部的横向微型CT切片如图1B所示：在靠近正常肺血管和支气管的外周和肺门区域均观察到肺灶。对正常解剖学的了解对于肿瘤和正常解剖特征的区分至关重要。CT检测的肺灶随后通过大量尸体解剖证实为肿瘤，通过组织学检查证实为肉瘤。图1C显示对应于局灶性肺损伤的H＆E染色部分的代表性场（倍率X400）。

微型CT对肺肿瘤体积估计的准确性

本研究纳入10只裸鼠，最终尸体解剖共鉴定出36例肿瘤，其中25例为微型CT。通过微型CT检测的最小肺肿瘤直径为0.85 mm。微型CT检测未发现11个肿瘤：4个肿瘤非常小（直径lt;800mu;m），远离纵隔，两个肿瘤（直径1.4 mm和1.7 mm）位于纵隔附近，另外5个 〜1.5 mm）位于后房。图2A中的散点图示出了微型CT估计的肿瘤体积和切除的肿瘤的质量之间的关系（r2 = 0.9667，N = 25，P lt;0.0001）。

通过串联微型CT扫描监测活体动物中的肺肿瘤进展

通过肿瘤细胞接种后的四只动物中的连续微型CT成像观察到单个肺肿瘤的生长。图3A显示了小鼠2中肺肿瘤进展的一组连续胸部横向图像。当其估计体积为6.6mm³时，接种后21天首先检测到该肿瘤。随后在第25天增长到约94毫米3，此时肿瘤和胸壁之间的边界看不清楚。有趣的是，在这种情况下，在心脏和前胸壁之间形成的肺的尖锐角度在第25天出现“钝”，“心脏阴影”显着增大，表明存在胸腔积液。尸体解剖后证实，在最后一次成像后立即进行，恢复约0.4mL的血液渗出。第25天显着增加肺密度（较高的CT数）; 这可以解释为由渗出形成和肿瘤进展引起的肺的收缩。这种成像特征可能代表疾病的终末期。使用微型CT在第25天检测到四只动物中共有五只肿瘤。其中三只在第18天首次观察到，两只在第21天。肿瘤生长曲线如图3B所示。 肺肿瘤在第一次观察到后生长非常快速; 然而，在研究过程中动物体重没有显着变化（图3C）。

对比增强型微型CT

图4A显示了含有晚期转移性疾病的肺的横断层摄影部分。肿瘤和血管与心脏一起显示出相似的CT数，但它们之间没有明显的界限。低密度肺组织是可见的情况很少。Fenestra VC管理后，心室和胸部血管显示增强的X射线吸收。然而，没有观察到肿瘤结节的增强（图4B）。因此，Fenestra VC没有改善肺肿瘤的可见性，但是增大了肿瘤与心脏和血管之间的区别。

转移酶的微型CT

骨转移的骨骼投影成像和断层扫描

图5显示了无病的正常成年雌性裸小鼠（图5A）和对比性雌性裸小鼠的骨骼投影图，其在七周前经历心脏左心室注射A549细胞（图5B）。图5B中的示例是左胫骨近端和右胫骨不规则的溶骨性病变，第8右肋（病变长度= 3.8mm），以及在中至右股骨右侧的几个高CT或CT值的病变。在图5C-F中示出了感兴趣区域中的横断层摄影切片。颅骨（枕骨）中的溶骨性病变在断层图像上可见（图5C），但在投影视图上看不见。通过CT估计该损伤的大小为1.9mm（图6A）。相反，长骨骼（图5D-F）中的病变在横向，冠状和矢状断层图像中比在投影图像中不容易看到。发现旋转图对于快速可视化的骨损伤和伪影的鉴别是有价值的。例如，与骨骼投影视图（图5B）上的椎骨相关联的非常高的X射线吸收伪影显示在腹部内，并且不使用旋转与骨架相关联（数据未显示）。

异常微型CT骨骼图像和组织学发现

图6显示了骨骼微型CT图像的异常和图5B中显示的小鼠中相应的H＆E组织学发现。组织学检查证实在涉及颅骨的微型CT溶骨灶（图6A），右肋（图6B），右胫骨（图6C）和左胫骨（图6D）的区域中存在肿瘤。H＆E染色切片的显微照片（放大X400）与骨癌区域内腺癌细胞的存在一致。本组共5只小鼠进行微型CT扫描和组织学检查。在一只小鼠中，通过micro-CT（组合使用投影视图成像，旋转电影和断层扫描）和组织学检查，没有确定骨转移。在其余4只小鼠中，16只骨骼通过组织学评估具有腺癌侵袭和溶骨性或成骨细胞变化。骨折转移瘤16例，其中15例（94％）显微型CT显像，但CT检查未发现椎骨骨溶解病变。通过微型CT显示的所有骨病变均通过组织学证实为骨转移。

讨论

在这项研究中，我们使用微型CT在裸鼠中非侵入性检测到多个肺转移。 来自CT图像的单个肺结节的体积的定量测量与切除的肿瘤的直接测量密切对应。我们还观察到活体动物肺肿瘤进展过程。使用连续微型CT研究，我们能够监测肺转移性疾病的进展，无论是肿瘤生长还是胸腔积液的发展，表明该疾病的终末期。然而，在具有晚期肺部疾病的这些动物中，体重或其他可观察到的症状没有明显的损失。

微型CT成像可以准确反映肿瘤和肺组织之间的体内空间关系以及肿瘤生长对功能肺容积的影响。因此，这种技术可能有助于估计功能性肺容量储备。

我们注意到肿瘤细胞接种后18天或以后通常检测到肺肿瘤（图3B）。这种延迟时间可能归因于来自微型CT的辐射剂量，但是这不太可能。在此之前，动物扫描两次（或三次），如下所述，每次扫描将产生约0.24Gy，远低于对肿瘤生长的

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