铬与黑曲霉变种ED8的相互作用机制外文翻译资料

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铬与黑曲霉变种ED8的相互作用机制

重点内容

ED8以降解铬（VI）作为作用方式，并且黑曲霉ED8也具有在细胞内捕捉铬的能力。铬（VI）的相关生物反应是在泡罩塔生物反应器中进行。黑曲霉ED8的干物质能减少2.62毫克铬（VI）在鼓泡塔生物反应器中。

摘要

进行实验，以确定相互作用的机制，分批培养，并在生物反应器实验的黑曲霉变种塔宾应变ED8的铬。在这项工作中获得的结果表明，黑曲霉变种塔宾ED8与铬（VI）的相互作用主要是在还原过程，也基于，其次，在吸附过程。利用电子显微镜技术，从通过在分批培养物中的真菌产生的菌丝体生物质所得到的超薄仲丁基系统蒸发散表明掺入铬在细胞内，进入低电子致密夹杂物的能力，但不细胞外。另一方面，黑曲霉变种塔宾ED8的无铬（VI）培养物，在泡罩塔生物反应器中生长，降低的铬（VI）立即经过反复加成此含氧阴离子的; 6加载后，460毫克铬（VI）在60小时降低到铬（Ⅲ），相当于2.62毫克铬（VI）克1-干生物量H 1的减少率。

1.简介

铬化合物被广泛应用于，如采矿，鞣革，不锈钢的生产，使用和废物铬（考尔德，1988年）。他们大量使用已经造成铬存在于土壤和高浓度的沉积物造成有毒性生活形式。在自然界中，Cr是表现为三价铬（III）和六价铬（VI）的物种。较高的氧化态，在铬酸盐和（或）重铬酸盐的形式，是对大多数器官主义剧毒，而铬（Ⅲ）是相对无害;在这个意义上说，它已报道的Cr（Ⅲ）比铬（VI）少100倍毒性（德罗拉等人，1990）。铬是1组内编目由有毒物质和疾病社报道有毒物质的优先级。 EPA（环境保护署，USA）中已建立的Cr（VI）的放电极限表面低于0.05毫克的L 1的水，而总铬包括铬（Ⅲ），铬（VI）和它的其他形式的低于2毫克的L 1 （巴拉尔和Engelken，2002）。铬相互作用的微生物机制是基本技术的相关性，由于这一事实的物理化学方法当前考虑在大规模除去CHRO-MIUM的是昂贵的，并导致大量的二次废物的产生（白居易和亚伯拉罕，2001）。生物修复实际上考虑重新移动的Cr从环境的替代（Mulligan等人，2001）;这个过程利用微生物的遗传和代谢的潜在生物转化和/或吸附去除金属（陈和郝，1998年，塞万提斯等，2001）。属于曲霉属，青霉-lium，木霉和毛霉丝状真菌已被描述为具有。Fukuda等人，2008; Morales的-巴雷拉和克里斯蒂亚尼-乌尔维纳，2006;相容性，以在活跃生长的细胞的培养物（Acevedo的-咀等人，2006年减少铬（VI）到铬（Ⅲ）。Liu等， 2007年）。其他作品所描述的真菌菌株与造成铬的摄取通过生物累积/生物吸附亲正如事实生物质能，利用不断增长的或灭活的细胞的能力; 。纳塞等人在cluded曲霉菌株中描述的菌株（，2002;杜和Sumathi，2005;塔瓦和撒库尔，2006年，B; Congeevaram等人，2007; Mungasavalli等人，2007; Khambhaty等人， 2009），被毛孢菌（塔瓦和塔库尔，2006年）和根霉（白居易和亚伯拉罕，2001）。一个额外的过程，被称为吸附偶联还原，这主要发生在酸性pH值，已脱刻划与曲霉属和Rhyzopus（Park等人，2005年，2007年）的灭活细胞。该bioadsorption过程发生在细胞表面主要在细胞外聚合物（EPS），FOL-lowed由运输到细胞质隔室，通过两道工序。第一是快速，特异性，并且通常基于化学渗透梯度（被动转运），并且由于它使用由各种底物，它是组成型表达。第二输送系统具有用于子施特拉特高特异性，是慢，经常使用ATP水解作为能量源（主动运输），但还可以通过渗透梯度的功能。捕获的金属可以与诸如亲teins丰富的巯基细胞（代谢途径中的酶），生理上存在或以金属（金属硫蛋白和植物螯合）存在下合成（王和陈，2009年）的化合物的复合物。在以前的作品中，黑曲霉变种的塔宾ED8的应变，在包含在GP黑曲霉种类复杂，表现出高艾菲 - 效率为Cr（VI）转化为铬（III）在细胞外基质中，以限制铬吸附生物质（阿塞韦多-Aguilar等，2006）。在ED8铬（VI）还原应变由羧酸和金属 - 螯合剂刺激的机制发生（COREN Alonso等人，2009）。本文的目的是研究黑曲霉变种塔宾ED8的捕获铬额外和细胞内，以减少铬（VI），通过在气泡塔型反应器开发化学分析装置和电子显微技术在培养物中的能力和它的效率。

2.方法

2.1.微生物和培养条件

黑曲霉变种塔宾ED8描述和表征前雇主-ously（Acevedo的-咀等人，2006;科雷诺-Alonso等，2009）在这项工作中使用。这种真菌菌株生长并在PDA培养基propa门控。铬使用该微生物（VI）的还原和铬吸附实验在分批培养中或在气泡同事分别实现（Lee等，1975）UMN生物反应器，使用改性李基本培养基（LMM）含有0.25％KH 2 PO 4，0.20％硫酸镁，0.50％（NH 4）2 SO 4，0.5％NaCl和0.25％葡萄糖;其溶解于柠檬酸盐缓冲液45毫和培养基的pH调节至5.3与45 mM柠檬酸和NaOH（科雷诺-Alonso等人，2009）。铬（VI）在LMM中等程度的降低实验含3毫米钠水杨酸（LMMS）补充有K2CrO4适量在配有鎓达到的Cr（VI）的指示的浓度如前所述在分批培养进行了（科雷诺-Alonso等人，2009）。在生物反应器实验中使用还原介质是基于在LMMS，但双重浓缩（2X），用在代替葡萄糖作为碳源的蔗糖;介质的成分是技术级反应活性，其溶解于柠檬酸盐缓冲器45毫米，且pH为5.3。培养基补充K2CrO4适量，到达初始的Cr（VI）的浓度。

2.2。批量培养实验

生物量产量在改性LMM介质和铬（VI）在补充有K2CrO4适量达到的Cr（VI）在介质中的指示的浓度LMMS介质还原的实验中，在分批培养物进行与前雇主-ously描述（Corentilde;o- Alonso等人，2009）。然后真菌类生物质转移到含有铬（VI）的50〜100毫克的L 1 LMM，并且样品在0，12和24小时进行分析。培养物FIL-羊羔和游离生物量的肉汤培养物用来确定铬（VI）还原，并在另一面，生物质被用来分析Cr的individ-UAL细胞额外或细胞内积累。未受污染的培养物作为对照实验。

2.3。扫描电子显微镜（SEM）和能量色散型X射线（EDX）微量分析

用于SEM分析，从分批培养真菌类生物质的样品固定在4％戊二醛的磷酸盐缓冲液（0.1M和pH值为7）2小时稀释，并在增加的乙醇浓度在相同的缓冲液洗涤四次，脱水（30％，50％ ，70％，90％和100％）和通过临界点干燥法干燥。最后，所有的SAM-普莱斯被安装在金属底座，涂以金为更好的图像对比度。在JEOL JSM-6300扫描电子显微镜（JEOL，东京，日本）来观看图像。为能量色散X射线显微分析，将细胞homoge-nously分布和与聚碳酸酯膜FIL-TER值过滤。这些滤器脱水和通过临界点干燥法干燥，然后用金涂覆。能量色散X射线规范-trophotometer（EDX）链路伊希斯-200耦合到一个蔡司EVO MA 10扫描电子显微范围（卡尔蔡司NTS GmbH公司奥伯科亨，德国）（牛津仪器，雄鹿，英格兰）在20kV操作用。最后，获得了从单个细胞的EDX-SEM光谱。

2.4。透射电子显微镜（TEM）和能量色散型X射线（EDX）微量分析

用于TEM分析，从分批培养真菌类生物质样品固定在戊二醛如上所述。以后，样品后固定在1％的OsO 4在4 LC 2小时，并在相同的缓冲液洗涤4次。然后将它们在一个分级系列丙酮（50％，70％，90％，95％和100％）的脱水并包埋在斯普尔的树脂。超薄切片（70纳米），用Leica UCG超切片机实现的，被安装在镀碳铜网上，并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。样品在日立H-7000透射电子显微镜（日立有限公司，日本东京，日本）观看。为能量色散X射线显微分析，为200nm厚的部分也进行染色用乙酸双氧铀和安装在碳涂覆的网格。样品的EDX链接耦合到在Jeol JEM-2011在20千伏操作伊希斯-200（牛津仪器，雄鹿，英格兰）（JEOL有限公司，东京，日本）进行分析。最后获得EDX-TEM光谱。

2.5。鼓泡塔生物反应器实验

经济增长和减少阶段：实验室规模鼓泡塔生物反应器是由高40厘米与1升反应器两个阶段工作的总容量为7厘米直径的玻璃柱制造。含有800毫升的LMM的柱用与8.5大号分钟1的空气流5 105孢子黑曲霉变种塔宾ED8毫升1的接种，并在60小时（生长阶段），在室温下温育。生长后，在排出的阶段，100毫克铬（VI）L 1从顺式交感原液浓度（55,000毫克的L 1）加入到该培养，其中载有真菌类生物质，和12小时期间温育。在此时间后，除去培养物初始体积的50％，并且用相同体积的新鲜2X李置换改性介质和混合TURE孵育12小时。在进一步的12小时温育期后，除去由含100mg铬（VI）L 1 2X新鲜培养基替换原体积的12.5％;这些孵育持续，直到从实验开始总共60小时。添加Cr后立即（Ⅵ）（T = 0），然后每3分钟，取5毫升样品，其中使用的Cr（VI）和总铬的determi国。在培养（60小时）结束时获得的生物量通过过滤回收，用蒸馏水反复洗涤，并冷冻干燥，得到其干重，然后将该生物质用于确定掺入其中的铬处理。

2.6。分析测定

铬（VI）用分光光度法雇用-ING二苯卡巴肼（DPC）进行定量（Greenberg等，1981）。如先前描述的培养物的上清，并在生物质总CHRO-MIUM含量通过ICP-MS测定（Acev-江户时代-Aguilar等，2008）。

3。结果与讨论

3.1。铬（VI）还原在分批培养

在LMM培养基含有50毫克铬（VI）L 1的初始浓度菌株黑曲霉变种塔宾ED8的孵育24小时后，观察到约94％，在铬（VI）水平的降低;在同一时期，在75和100毫克铬（VI）L 1介质，ED8菌株的生物质引起的Cr（VI）的水平（表1）的约60％和56％的降低。培养物的pH值从5.3仅更改为5.0，因为缓冲器柠檬酸盐在介质中。已经说明，在与50mg铬（VI）孵育ED8菌株培养物L 1与在该研究中采用的那些条件下，大多数（gt; 98％）总残留铬是在SOLU-灰发现，提供指示的证据可溶性铬（Ⅲ）复形换息，与铬（VI）还原随之增加（Acevedo的-Aguilar等，2008）。在中前S-ENCE培养100毫克铬（VI）L 1 ED8应变文化的Cr（VI）水平不太明显的去折痕的观察，可能是由于铬（VI）的毒性作用。

3.2。铬（VI）富集/吸附在分批培养

尽管已知在活跃生长的真菌细胞的Cr（VI）由硫酸盐通透酶蛋白质的手段掺入（Cervan-TES等人，2001）或由式CHR-1转运（Flores的-Alvarez等，2012）较少有人知道，使离子结合到该细胞表面上的特异性分子;在某种程度上，这是由于该微生物生物质，这是不容易适合于仪器分析（卡普尔和Viraraghavan，1995年）的复杂NAT-URE。在这项工作中，高分辨率电子显微镜，SEM和TEM，和不同的技术都联接到EDX分别铬（VI）减少由黑曲霉变种ED8塔宾在LMM肉汤培养。优化，并用于确定黑曲霉变种塔宾ED8的捕获铬（VI）的额外或细胞内的能力。从未受污染的样品获得的，因为它是前存在意外的结果，铬没有在细胞中或在细胞外水平（SEM-EDX），或在细胞内水平（TEM-EDX）进行检测。由铬（VI）的污染，并且通过扫描电镜分析黑曲霉变种塔宾ED8的样品中，显示对真菌HY-东城形态变化，在两者的Cr浓度50毫克L 1和100毫克的L 1，并在不同的曝光时间。在离子的最高concentra-灰观察Cr对真菌的形态的最具戏剧性的效果（VI），因为所产生的菌丝呈短的，弯曲的和沿其长度收缩。然而，铬是不符合他们的EDX谱图检测。从这些结果可以得出结论，黑曲霉变种油管对虾ED8细胞不能从外部吸附这种金属，无论是在表面和/或所述EPS。由真菌中的菌丝TEM分析显示超结构改变亲duced若这在铬（VI）的存在下生长。观察到两种不同的电子密度夹杂物。第一类型是高电子密度和较高的Cr浓度在数量增加。通过细胞壁这些夹杂物DISTRIB-布式进入细胞的周质空间。 Burnat等。 （2010年）确定这种类型的夹杂物，通过TEM-EDX，铅在Microcoleus财团聚磷酸盐的夹杂物POL-luted。虽然不同的作者已经证明了高电子密度夹杂物的捕捉的金属的能力，在这些内含物的EDX光谱中没有检测到铬（Burnat等人，2010; Maldonado等人，2010年，2011;埔盐等， 2012;家宴，科洛米纳等，2013）。第二类型的夹杂物为低电子密度，并在暴露于铬（VI）的样品进行观察。这些夹杂物利用TEM-EDX的分析允许在该EDX谱图5.4千电子伏能量的Cr的主要峰的检测。结果表明黑曲霉变种塔宾ED8的在细胞内捕获该金属的能力。

3.3。铬（VI）还原在生物反应器中柱

以往的研究表明，该菌株黑曲霉变种塔宾ED8具有降低的Cr（VI）中的胞外ENVIRON-换货的能力，具有低量铬的结合于生物量（Acev-江户时代-Aguilar等，2006）和这个容量减少铬是由有机酸刺激（科雷诺-Alonso等人，2009）。考虑到这些观察结果加以考虑，我们设想了快速和有效的方法为铬（VI）还原由培养A. NI-GER变种塔宾ED8在气泡塔型反应器中的情况下的Cr（VI），随后通过除这种离子和随后的中和Cr（VI）的负载进一步潜伏期的文化。因此，黑曲霉变种塔宾ED8的培养物孵育在LMM和铬（VI）60小时，然后加入。该介质没有明显改变的pH值;它为5.3和5.0之间，因为减少介质含有柠檬酸盐缓冲液

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