嗜麦芽窄食单胞菌SeITE02对亚硒酸盐的生物转化和解毒： 纳米硒的细菌的生物合成途径的新线索外文翻译资料

英语原文共 12 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

嗜麦芽窄食单胞菌SeITE02对亚硒酸盐的生物转化和解毒：

纳米硒的细菌的生物合成途径的新线索

1. 嗜麦芽窄食单胞菌seite02能够有效还原有毒的亚硒酸盐转化为纳米单质硒颗粒。

2. 含硫醇的分子参与了将亚硒酸盐还原成单质硒的反应。

3. 生物体系是被碳水化合物、脂肪和蛋白质覆盖。

4. SeNPs种子在细胞内形成，然后释放到细胞外。

摘要

一个假定的由嗜麦芽窄食单胞菌seite02 高效的还原亚硒酸钠（SeO32-）并产生纳米硒（硒）的生物合成机制已经在依靠一组由化学/生化，显微镜和蛋白质组学分析等相结合的一种生理性的的方法获得的信息为基础得以证明。嗜麦芽窄食单胞菌seite02被证明能够将亚硒酸盐有效地转化为单质硒并且在含有0.5mmol的有毒性的氧离子的液体培养基中培养48小时能够完全转变为纳米硒。

由于嗜麦芽窄食单胞菌seite02的亚硒酸盐还原活性是在细菌细胞质中的蛋白质中检测到的，然而检测显示微生物还原产生的单子硒大部分存在于细胞膜外，因此一个单子硒是在细菌细胞内环境中产生并释放到细胞外的机制的假设被提出来。硒呈球形，大小从160纳米到250纳米不等，取决于培养的年龄。对嗜麦芽窄食单胞菌seite02 的细胞质蛋白进行蛋白质组学分析检测得知其蛋白质与乙醇脱氢酶的同源，充分证明嗜麦芽窄食单胞菌seite02的细胞质蛋白与单子硒的形成有密切的联系。最后，通过傅立叶红外光谱法可以检测到除蛋白质和脂质表面外其它组织上均附着的单子硒。

关键词：乙醇脱氢酶、生物纳米硒、生物修复、亚硒酸盐还原、

嗜麦芽窄食单胞菌seite02

1引言

硒是一种非金属，天然存在的元素，是人类和动物进行生命活动所必需的微量元素，但是当其摄入量高于膳食剂量时浓度过高会产生对人体和动物有害的毒性，人体对硒的需要量与中毒量非常相近。它是当今各种生活功能的关键组成部分生物体，除了高等植物和酵母。对人类而言，硒的营养功能的得以实现是由硒蛋白的第25个氨基酸硒代半胱氨酸，因为硒结合到硒蛋白的活性中心。在自然环境中，硒存在四个氧化态：硒酸盐，亚硒酸盐，硒化物，单子硒。在自然条件或人为条件中硒的性质和毒性取决于它的化学形态，水溶性阴离子亚硒酸钠（SeO32-minus;）和硒（SeO42-minus;）对生物显示出最高的毒性作用。微生物在该元素的生物地球化学循环中扮演重要角色。某些微生物菌株，能够抵抗的硒含氧阴离子的毒性是依靠菌株对亚硒酸钠和/或硒酸盐还原到更少的元素形式（即元素硒等被称为非晶体或胶体硒，在水溶液中沉淀为红色的橙色聚集体）或甲基硒形态，可能被视为治理污染土壤，碧柔调解沉积物、工业废水、农业排水水域等的

潜在的生物催化剂。根据种类，微生物还原被认为是一种解毒机制，保持氧化还原电位，或呼吸电子转移链的一部分。另一个有趣的事实是，在降低硒含氧阴离子的同时，其中的一些微生物在细胞内或细胞外会产生纳米硒（硒）的积累。

生物单质硒体系主要是球形或卵圆形，尺寸为10～400nm 之间。值得注意的是，这些体系具有特殊物理特性的关注，如光电，半导体和x-ray-sensing性质，使他们技术应用的可能性非常的吸引人。最近的研究表明，硒能发挥较高的抗菌活性，对人体致病的细菌，如金黄色葡萄球菌具有很强的免疫抵抗作用。在这项研究中，硒的解毒机制和硒合成的环境细菌分离（嗜麦芽窄食单胞菌seite02 ）已使用生理，化学/生化，显微镜，和蛋白质组学分析等方法逐步被调查。在细菌细胞的定位体系，也通过电子显微镜如SEM（扫描电子显微镜）和TEM（透射电子显微镜）来分析确定。此外，信号EDX（能量色散X射线分析）测量进行了评估，以验证所观察到的纳米颗粒的组合物。该体系由生物合成的嗜麦芽窄食单胞菌seite02特征也被确定通过动态光散射（DLS）、Zeta电位和傅里叶变换红外（FTIR）分析。对这些体系的形成相关蛋白的初步鉴定是由当时的一维凝胶电泳和质谱鉴定手段HPLC芯片进行的。

1. 材料与方法

2.1化学品，培养基和实验方案

化学品都是分析纯，从西格玛奥德里奇（米兰，意大利）购买的；营养肉汤和细菌以及琼脂则分别由加巴纳特米兰，意大利等处购买；亚硒酸盐是由100mmol的原液在加入适量的去离子水后再通过无菌过滤而得到。

2.2 嗜麦芽窄食单胞菌seite02的培养

嗜麦芽窄食单胞菌seite02最初是从硒超富集植物物种在富硒土壤种植黄芪根际分离。通过培养细菌管含有5毫升的营养液，接种菌株seite02 27◦C 48 H在轨道摇床制备细菌预接种用于所有的实验测试。

2.3 嗜麦芽窄食单胞菌seite02 还原亚硒酸盐（SeO32-minus;）和单质硒的

形成

在250 mL三角瓶培养中加入100mmol 的营养肉汤，分别加入0.5，2，3或5mmol的亚硒酸盐并加上标签。细菌培养物在27◦C在有氧条件下在轨道摇床转速200 rpm。细菌的生长状况通过对其菌落形成单位进行营养琼脂平板计数法测量，同时亚硒酸盐和单质硒则通过分光光度法测定。

为了更好地了解硒还原机制和硒的动力学形成，进一步的实验是通过添加0.5mmol亚硒酸盐与培养基中进行摇床培养，并且在不同的时间段对细菌生长浓度进行测量，即在6，14，18，23和48 h对细菌生长浓度进行测量。亚硒酸盐和硒的含量由上述方法进行测定。测量出来的数值可表示为每个细胞将亚硒酸盐转化为单质硒的还原率。

2.4。扫描电子显微镜和能量分散X射线分析（EDX）

将样品seite02菌株加入到含营养肉汤的液体培养基中，同时添加0.5mmol亚硒酸盐进行摇床培养，分别收集24小时和48小时后的培养物。细菌细胞颗粒通过离心10 min，然后在2.5%戊二醛固定24小时。后来，冲洗细胞三次在磷酸盐缓冲液（0.2 mol Lminus;1）和乙醇系列脱水（30%，50%，70%，90%，和100%）。最后，它们在被使用液体二氧化碳的基础上进行干燥是该实验的关键点方法。细胞，被安装在金属试样存根并且被喷射镀膜碳（MED 010巴尔查斯），然后直接检查用扫描型电子显微镜（扫描电镜）观察。观察主要采用背散射电子（BSE）进行发射模式，用环境扫描电镜（FEI-Philips）配备能与安微分析系统。

2.5 透射电镜（透射电子显微镜）分析

样品嗜麦芽窄食单胞菌seite02培养生长在存在或缺乏0.5毫米亚硒酸盐的培养基中，培养13，16，21，34，24h ，经过9次的生物过程中，收集不同的形成体系。细胞以6000克的50ml Falcon管中离心。最后，在透射电子显微镜进行制作观察和其他地方的观察并且对样品进行了描述。

2.6 对生物催化亚硒酸钠还原的定位分析

检测不同细胞蛋白组分的催化亚硒酸钠还原（即细胞质，细胞膜）以及与胞外多糖（EPS）矩阵，和细菌培养上清。

2.6.1 蛋白质的提取

500毫升等分的seite02在27◦C，200 rpm轨道摇床条件下黑暗培养孵育48 h，然后离心10000r/min（sorvall T21离心机）10分钟在4◦C获得细胞颗粒。颗粒在生理溶液洗涤两次（0.9%氯化钠）和颗粒再次接受周质蛋白增溶的奥斯本和曼森描述过。细胞悬浮在一个冰冷的缓冲溶液中5分钟；然后溶菌酶加入终浓度为0.4 g/L。这种悬浮液保持在冰上还有2分钟，在冰冷的15毫米EDTA溶液的pH值为8的溶液中缓慢提供超过10分钟的时间内。最终，这个球状体颗粒通过离心（sorvall rc-5c加超离心机）在10000 r/min，20分钟然后悬浮在10毫升的溶液中含有50毫米氯化钠一片完整的蛋白酶抑制剂，而上清液由周质蛋白馏分回收、过滤，最终用minus;20℃液氮冷冻储存。原生质体的破坏是由超声波发生器配备钢尖端手段实现（Hielscher up50h），重复7轮40秒超声/40秒的休息每个周期，而在冰上保持样品始终处于低温状态。超声处理后的溶液离心75min。在上清液中存在的可溶性细胞质蛋白回收，过滤和立即在液氮中冷冻，而膜片段，在离心机底部可见一个棕色小球管，溶解在50 mM磷酸盐pH 7.4的缓冲液10毫升含0.5% TritonX-100溶液，冷冻和储存在minus;20◦C。

2.6.2 EPS提取

如上述参考文献所述，经过5天的生长，嗜麦芽窄食单胞菌细胞离心30分钟。提取进行了描一旦这种多糖基质沉淀，离心30分钟并悬浮于蒸馏水。

2.6.3 上清准备

对含有SeITE02菌株的营养肉汤进行培养并且在不同的生长时间段收集培养物上清，即0，24和48小时培养后的培养物上清。随后通过过滤用磁盘制备用于分析的样品。热处理样品通过在121◦C煮沸15分钟获得的。

2.6.4 SeO32还原活性测定

如文献所述测量由细菌培养进行亚硒酸盐还原成硒元素的还原活性，即产生红色的描述。该红色物质的颜色是水溶液中单质硒的典型颜色。在微孔板的形成被假定作为生产元素硒的证明。

2.7 蛋白质组学分析

2.7.1 一维天然凝胶电泳

如前所述，用一个浓缩得到细胞质蛋白质级分。样品的最终浓度为6毫克每毫升。蛋白质上分离6-13％梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。原产标记染色标准蛋白作为标记。电泳迁移进行60分钟，然后在300mA4小时。此后，凝胶剂或切下凝胶泳道被转移到一个酶谱缓冲器。然后凝胶孵育上用含有1mM NADH和100mM Na2SeO3。活动从一个红色波段的外观进行了测定，表示硒的为元素还原的McIlvaine缓冲液（pH6.0-6.6）培养皿硒。

2.7.2 胶内消化和肽鉴定纳米液相色谱 - 芯片MS / MS

红色条带从凝胶小心切下并进行凝胶内胰蛋白酶消化。从每个样品的5·L等分肽通过反相分离相纳米HPL C-芯片技术（安捷伦科技，帕洛阿尔托，CA，USA）在线加上3D离子阱质谱仪。蛋白鉴定通过使用吉祥物方案在国家生物技术信息中心的非冗余数据库（NCBI nr个）搜索（http://www.matrixscience.com）中进行。

下面的参数被采纳：具体的胰蛋白酶的消化，最多一次手裂解;固定和可变的修改：半胱氨酸和氧化（MET），分别;肽和碎片公差：plusmn;0.9 Da和plusmn;0.9大，分别与肽费： 1， 2和 3。蛋白被确定为基于各个肽离子得分显著命中（P lt;0.05）。其中P的概率是所观察到的匹配是一个随机事件。当单个离子的得分超过阈值（＞60）为一个随机事件，它表明序列同源性或广泛的同源性（对0.05）。该点的身份被确立为蛋白质，产生了最高的得分，因此，与肽序列的最佳匹配。

2.8。嗜麦芽窄食单胞菌seite02产生的体系特征

2.8.1 单核苷酸多态性从SeITE02的细菌培养物制备

如通过在107CFU毫升-1英寸营养肉汤的用0.5mM亚硒酸钠最终浓度接种菌体如上所述制备SITE02培养物。细菌细胞和纳米颗粒以10000r/min进行10分钟6，24和48小时通过离心后从培养基中除去。沉淀物用0.9％NaCl溶液，再悬浮于Tris/ HCl缓冲液（pH值8.2）洗涤两次，然后通过超声波以100W5分钟中断。然后将悬浮液以10000r/min离心30分钟以破碎细胞（粒料）从纳米粒子（上清液）分离。纳米粒物在10000r/min进行30分钟，洗涤两次，并再悬浮于去离子水离心后回收。

2.8.2 动态光散射（DLS）分析和zeta;-电位测量

DLS分析是通过使用来自马尔文仪器禅3600纳米激光粒度仪ZS（伍斯特郡，英国）装配有633nm的氦 - 氖激光光源（4.0毫瓦），以便在173◦一个固定的角度来检测散射信息进行。从样品300·L等分试样转移到记录在25◦C石英比色皿（10 mm光程）和数据。记录数据平均粒径分布都是测量颗粒的粒径分布和Zeta电位。使用随仪器提供的软件得到所有登记的值。

2.8.3 红外光谱测量与数据处理

合成SeNPs5微升等份通过化学（ChemSeNSe）或生物（生物传感）分别落户到氟化钡支持和测量前40◦C干燥24小时。化学合成SeNPs得到如下：0.25毫升的50mM L-半胱氨酸溶液滴加入到0.25毫升的0.1M亚硒酸钠的。然后将混合溶液搅拌在室温下30分钟。在传输模式中红外光谱在4000-700厘米使用连接到海波3000可见光/红外配备了光导MCT检测显微镜顶点。对于这两种样品，10逐点谱在4cm -1的在50mu;mtimes;50mu;m区通过共加入64扫描（大约30秒采集时间）获得的。吸收光谱进行基线校正和面积归一化在4000-2400厘米-1的范围，并在1800-700-1范围分别。

2.9 统计分析

所有数据的平均值是三个独立的实验组。被提出每个值作为平均值plusmn;标准偏差（S.D.）。统计分析通过使用Tukey的的事后检验来评估的装置是否显著不同单向ANOVA进行。显着性水平设定为P lt;0.05。统计计算采用SPSS16.0的Windows（SPSS公司）进行的。

3 结果与讨论

S.麦芽SeITE02已从黄芪植物生长于富硒土壤的根际先前分离和被证明是高度耐SeO32-并将其与所观察到的形成SeNPs的减少成元素硒需氧生长的条件。本研究的目的是阐明硒纳米粒子的生物合成的生物机制（S）由S.麦芽SITE02以及其效率，以减少和解毒此含氧阴离子。

3.1 在硒浓度增加的情况下SeITE02的生长

对所有亚硒酸钠的浓度进行测试，对嗜麦芽窄食单胞菌seite02的生长起到抑制作用的浓度（如图1）所示。对应于不同SeO32-浓度生长动力学的数据（0.5-5.0毫摩尔L-1）表示，

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[148606]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word