响应曲面法优化长白楤木根中长白楤木酸超声波辅助提取工艺的研究外文翻译资料

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响应曲面法优化长白楤木根中长白楤木酸超声波辅助提取工艺的研究

金孝善bull;李永bull;乔纪恩 bull;Byeong Cheol Moon bull;Yunui Ji bull;Ho Kyoung Kim 韩国药学会 2014年

摘要：为优化从主要化合物长白楤木的根中提取长白楤木酸的条件，我们建立了一个响应曲面法模型。利用高效液相色谱和上紫外检测对长白楤木酸产量进行分析和量化。用中心合成设计法优化超声波辅助萃取的三个主要因素：提取溶剂、 温度、时间。方差分析表明模型拟合良好 (R2 = 0.9323)。长白楤木酸提取实验在提取温度为33℃ 、提取时间为 28 分钟并以 100%乙醇作为溶剂时获得的最大1.0138%。实验值（产量 1.0103%) 与这些预测值吻合较好。结果清楚地表明可以通过有效地应用统计设计质量优化长白楤木酸的提取工艺。

关键字：长白楤木超声波辅助提取 优化 响应曲面法 长白楤木酸

引言

长白楤木北川 （五加科） 是一种多年生的草本植物，广泛分布在亚洲东北地区，包括中国和韩国 （孙等人，2012年）。它的根可被用作中药治疗可以入药，有祛风除湿，活血化瘀，解毒的功效（Jeong et al. 2006）。这种植物的根有多种功能性成分，包括精油、 二萜酸、 黄酮类化合物和皂苷 （孙等人，2012年; 孟等人，2012年)。长白楤木酸被认为是长白楤木中最丰富的二萜酸(李等人，2009年)，是主要的生物活性成分之一。例如，长白楤木酸具有抗菌（郑某等人，2006 年），HepG2 细胞抑制 (Kwon et al.2008)（汉等人 ，1983年），抗炎和抗龋齿 （玉等人，2006 年） 等活性。

超声波辅助萃取（UAE）技术是利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。它具有许多优点，例如用时短、所用溶剂少、提取率高和低成本的高质量产品；因此，它广泛应用于提取天然产物（布加略等人，2007 年;穆斯塔法 2009年）。

一般情况下，提取工艺的优化是通过经验或是统计方法 （LiyanaPathirana 和 Shahidi 2005年;Juntachote等人，2006 年）。实证的方法被称为单因素方法，在其中一个因素变化的时候，同时保持其他因素不变 （Bascedil; 和Boyacı 2007）。它的主要缺点是它并没有变量之间的交互效应（贝等人，2008年）。响应曲面法（Response surface methodology，RSM），一种高效的统计技术，可以通过允许同时调查变量以及它们的相互作用，优化复杂的提取过程（刘等人，2011 年;宗等人，2010年）。响应曲面法的最普遍形式是中心复合设计 (central composite design ，CCD)。中心复合设计由Box和威尔逊首次提出，作为替代以减少所需的实验来评估少量的决定性因素 （Box和威尔逊，1951年;Teoacute;filo 和费雷拉，2006 年）。中心复合设计允许建设统计模型与图形表示响应面（费尔南德斯等人，2011年）。这种方法能够准确地预测出最大化期望响应的最优条件（Teoacute;filo 和费雷拉，2006 年;多斯桑托斯等人，2005年）。文献包含几项使用中心复合设计方法优化提取多种化合物的研究（巴拉德等人，2009 年;Cheok 等人,2012年;汗等人，2010年）。

考虑到长白楤木丰富的自然资源及其很高的长白楤木酸含量(Ahn等人，2000)，从长白楤木中提取长白楤木酸的工艺优化研究将有很高的实用价值。虽然响应曲面法已用于优化提取黄酮类和皂甙 （孟等人，2012年），但尽我们所知，没有从长白楤木中高效提取长白楤木酸的报导。因此，为进一步的开发和利用长白楤木资源，在本研究中我们试图优化从长白楤木根中提取长白楤木酸的提取条件如温度、时间和乙醇浓度。

材料和方法

仪器与试剂电子电离质谱分析(Electron ionization mass spectrometry ,EI-MS) 使用日本电子 JMS 700 W（日本） 的质谱仪。H 和 13 C 核磁共振谱 (H- and 13C-nuclear magnetic resonance ,NMR)使用布鲁克阿旺 600（德国） 核磁共振谱仪和 CDCl3.薄层色谱法使用默克 Kieselgel 60 F254 （德国）。HPLC grade试剂的纯度达到色普级 99.99% 通常做高效液相色谱用（试剂的纯度达到色普级 99.99% 通常做高效液相色谱用），甲醇乙醇，异丙醇，正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，丁醇，和蒸馏水，获得来自 J.T.贝克（美国）有限公司。

植物材料

长白楤木根是从韩国庆尚道泗川寺收集，由由博士 D.Yunui 吉进行验证。这种材料凭证标本已存放在韩国东方医学研究所草药医学资源组的植物标本室(KIOM)。样品用粉碎机粉碎成粉末，然后用60 目筛过筛。

长白楤木酸的分离

干燥的长白楤木根（300 克）在超声下用甲醇提取3 次，时长为2 h.甲醇提取物进行浓缩、 悬浮于水中，并按顺序使用 n-己烷、二氯甲烷，乙酸乙酯和丁醇分馏。对于各种馏分，n-己烷馏分用n-己烷重结晶纯化为产量的化合物1。结构为(-)-pimara-8(14),15-三元乙丙橡胶-19-oic酸 (长白楤木酸)的馏分以其光谱数据（EI 质谱、 核磁共振和 13 C质谱) 确定（韩等人，1983年）。长白楤木酸的结构如图 1 所示。

样品制备

长白楤木酸的超声波辅助萃取（UAE）使用配备数字计时器和温度控制器的超声波设备（8510E-DTH; Bran-sonic Ultrasonic Co.Ltd., USA)。根据响应曲面法（Response surface methodology，RSM）所设计的，取约 0.5 克粉末放置在一个封口小瓶中，用20毫升的乙醇与蒸馏的混合液提取两次。随后，精确地量取提取液加入到50 毫升容积瓶中，在进行高效液相色谱法分析前通过 0.2-lm 微滤膜过滤。

长白楤木酸含量的测定

色谱系统用于确定长白楤木酸的含量。高效液相色谱系统由液相 2695系统和2996光电二极管阵列探测器构成。使用1授权 1154软件进行数据处理（Waters Co，米尔福德，马萨诸塞州，美国）。采用Hydrosphere C18色谱柱进行分离(4.6 9 150 毫米，5 lm，YMC)。25 分钟的等度洗脱的流动相由水，乙腈和0.1%乙酸组成，与溶剂的配比为28:72 (v/v)。紫外波长扫描范围为190-400 毫微米，并记录在 205纳米。流动率为1.0 毫升/分钟，注射量为0.1ml。圆柱温度维持在30 ℃。通过比较与标准化合物色谱的保留时间来确定长白楤木酸。六个不同浓度的长白楤木酸用于构建一个校正曲线。

选择溶剂型和单因素试验

为了选择合适的溶剂进行了初步实验。35 ℃时在超声中以乙醇和甲醇提取0.5 g 样品30 分钟。根据白楤木酸的含量选取最好的溶剂。

不同的因素下从0.5 g 的样品中所得的各个提取物和对于每次试验的详细条件如下︰首先，研究了提取时间对提取的影响。在45℃下用 80%乙醇提取样品不同时间（25-65 分钟）至20 毫升。其次，我们研究了提取溶剂的浓度对长白楤木酸产量的影响。20 毫升不同浓度的乙醇（50-95%)在45 ℃下提取 35 分钟。在不同温度（30-70 ℃）下， 20 毫升80%的乙醇提取35 分钟以考察了提取温度对提取效果的影响。所有的统计分析数据采用方差分析（Analysis of Variance，简称ANOVA）。

实验设计

中心复合设计 (central composite design ，CCD)用于确定从长白楤木中提取到最大量长白楤木酸时提取变量的最佳组合。中心复合设计是最常用的响应曲面试验设计，由包含中心点的因子设计或部分因子设计组成，并用一组轴点（或星点）进行了增强，以便对弯曲进行估计。中心复合设计在顺序试验中尤为有用，因为经常可以通过添加轴点和中心点来基于以前的因子试验进行构建工作。在这次调查中这3个测量的变量被计划的现代质量管理统计软件Minitab 16（minitab，Inc.，宾夕法尼亚州州立学院，美国） 程序，利用各自的条件对每个需要优化的变量进行编码 （-1.682, -1,0, 1, 1.682）︰ 提取温度 (X1，℃: 33，40，50，60， 67)，提取时间(X2，min: 28， 35，45，55，62)，和酒精浓度(X3，%: 75，80，88，95，100)。整个设计包括20实验点列在表1和 6 复制（运行 15-20）所用的中心点。广义的二阶多项式模型所得出的响应曲面分析结果如下︰

Y = b0 b1X1 b2X2 b3X3 b11X1X1 b22X2X2 b33X3X3 b12X1X2 b13X1X3 b23X2X3

Y是预测的响应；X1、 X2、 X3 因素的编码值；b0，bi (i= 1，2，3） 和bij(i = 1，2，3; j = 1，2，3，i小于或等于 j) 是拦截回归系数，分别为相互作用二次线性项（金等人，2010年）。

结果与讨论

高效液相色谱分析

记录在 205 nm处的典型的从长白楤木中提取长白楤木酸的HPLC 色谱图显示在图 2 中。在浓度范围为0.0025-5毫克/毫升，大约 21 分钟处发现主峰;回归方程是 Y = 15578X-62111 (R2 = 0.9993)。

溶剂型的选择和单因素试验

对于提取目标成分，溶剂的选择是最重要的因素之一（王等人，2012年）。通过比较用甲醇和乙醇提取长白楤木酸时的含量选择最佳提取溶。剂用乙醇和甲醇提取长白楤木酸的收益率分别为 0.898%（plusmn; 0.015） 和为 0.839%（plusmn; 0.005）。当使用乙醇提取时长白楤木酸含量明显较高，这表明通过 t 检验 (p小于0.05) 有统计学意义。对于各种醇，乙醇允许在制药化工业和食品工业使用（金等人，2010年）。因此，乙醇被选作接下来的提取实验的最佳溶剂。

不同的时间对提取长白楤木酸产量的影响如图 3A 所示。当提取时间为 35 分钟时，长白楤木酸提取取得了最大值0.927%，然后在35 分钟(p[0.001)后下降，这可能是由于在超声活动下发生了生物降解(王等人，2012 年）。超声可诱导声空化和植物细胞破裂（梅森等人，1996年）。破裂的气泡将促进溶剂渗透进入植物细胞，从而分解目标成分（Wang 等人， 2012年）。然而，随着提取时间延长，因其相对较大的比表面积和回收化合物产量的减少，目标成分将重新吸附在破碎的植物颗粒上（东等人，2010年）。图 3B显示了乙醇浓度对长白楤木酸提取率的影响。当乙醇浓度从50%增至95%(p小于0.001)时，长白楤木酸的提取率明显从0.780增至0.939%。图 3C显示了提取温度对长白楤木酸提取率的影响，当温度从30℃增至50℃时，长白楤木酸的提取率从0.900增至 0.922%，然后有下降的趋势 (p小于0.001)。高温可以增加分子运动，因此，高温度溶液将会溶解植物细胞里的长白楤木酸(胡等人，2012 年）.然而，过高的高温度高于50℃长白楤木酸的产率降低。

拟合模型

方差分析（Analysis of Variance，简称ANOVA用于评估意义和模型的适应性，以及影响重大的个别条件和选择反应的相互作用（Fer-nandes 等人，2011年） (表 2)。用于两个及两个以上样本均数差别的显著性检验。 由于各种因素的影响，研究所得的数据呈现波动状。造成波动的原因可分成两类，一是不可控的随机因素，另一是研究中施加的对结果形成影响的可控因素。方差分析是从观测变量的方差入手，研究诸多控制变量中哪些变量是对观测变量有显著影响的变量。调整后的 R 2 应该总是在0 和 1 之间，以便该模型可以契合实际的数据，当 R 2 值为 1.00 （(Vohra and Satyanarayana 2002; Sin et al. 2006)。在此研究中，这个模型的决定系数 (R 2)是 0.9323，该值表示这个计算模型能够解释 93.23%结果。在p 大于0.05时这个模型无明显适应性，无明显适应性表明二次模型对于响应变量的空间影响是有效的（刘等人，2010年）。使用 F 试验和 p 值确定每个系数的意义（陈等人，2010年）。如果绝对的 F 值变得更大和p值变得更小 ，相应的变量会变得更重要（杨等人，2009年）。在本项研究中，当高 F 值分别为131.81，63.46和 78.44， p 值小于0.0012时，整体而言线性、 二次，及相互影响是意义重大的，这也表明这个模型是非常重要的。

响应面法

响应曲面法（Response surface methodology，RSM）是比传统方法更有利，因为前者可节省时间，空间和原料。在使用响应曲面法时优化了三个因素：提取温度 (X 1)，时间 (X2)，和乙醇浓度 (X 3)。使用以下的二阶多项式方程确定响应变量和自变量之间的关系。

Y = 0.918319 0.000991766 X 1 0.0121496 X 2-0.00646408 X 3 7.39082 *10-5 X 22 2.26021*10-5 X 22 0.000100630 X32-4.11588*10-5 X 1 X 2-8.83164*10 5 X 1 X 3-1.44862*10 4 X2 X

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