菊花CmHRE2基因克隆与功能鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究目的和意义

菊花在花卉生产中占有重要地位，主要应用方式有鲜切花、盆花、园林地被等，切花菊生产上多采用设施栽培进行周年生产，因菊花根系较浅，不耐涝，集中性降雨，低温和土壤盐碱化都会影响菊花切花品质。另外生物胁迫也是影响菊花生产的重要因素，如蚜虫、叶螨和一些病原菌会严重影响菊花的生长发育，其中蚜虫是危害菊花最严重的虫害，从苗期到花期都受到蚜虫危害的可能，蚜虫分泌物会诱发病害，导致观赏品质下降，极大影响菊花的产量质量，已成为限制我国菊花产业发展的重要因素。随着分子生物学技术越来越广泛地应用到提高植物的抗性研究，通过基因工程手段挖掘菊花的优异抗性基因并由转基因手段获得高抗的转基因株系，来解决生产实际问题已成为可能，优异基因的挖掘和贮备对于转基因育种而言则具有十分重要的意义。

hre2是一类重要的转录因子，在植物抗逆和发育中发挥着重要的作用。菊花中cmhre2尚未得到克隆，其具体作用还没有被详细阐明，因此，克隆cmhre2基因并对其功能进行鉴定有利于优异基因的挖掘和实现菊花种质创新。

2. 研究的基本内容和问题

1．研究目标

(1)克隆得到cmhre2基因全长，并解析其响应胁迫表达的特性。

(2)获得cmhre2转基因菊花，初步明确其功能。

3. 研究的方法与方案

4.1研究材料

南京农业大学菊花种质资源中心保存的切花菊品种‘神马’。

4.2研究手段

高保真PCR克隆CmHRE2全长；qRT_PCR技术分析表达特性；重组法构建植物表达载体；利用农杆菌侵染法转化‘神马’并进行转基因鉴定，分析转基因株系对蚜虫胁迫的抗性。

4.3具体方法

4.3.1高保真PCR

①根据转录组拼接结果设计CmHRE2全长引物，以cDNA为模板，进行高保真PCR扩增。高保真酶反应体系与程序如下：

1)反应体系50 μl ：

2)反应程序：98℃ 30 sec; 98℃ 10 sec, 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec/1 kb, 30 个循环；72℃ 7min；4℃保温；

②电泳

将高保真PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取特异性条带进行切胶、纯化；

③ 将上述步骤②中的纯化片段进行加A尾，体系如下：

混匀，离心，72℃保温30 min；

④加A尾产物再进行纯化，所使用的纯化试剂盒是：TaKaRa DNA Fragment Purification kit Ver.4.0。

⑤上述步骤3中的纯化产物进行连接、转化、测序。

4.3.2荧光定量(qRT-PCR)

每20 μl qPCR反应液中包含10 μl SYBR Green PCR master mix，上、下游引物各0.5 μM以及10 ng cDNA。加样体系如下：

把荧光定量板置于Mastercycler ep realplex 2 S(Eppendorf，德国)定量PCR仪中，设定荧光采集通道以及读取荧光步骤，PCR反应按照以下反应程序进行：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，40个循环；最后加入溶解曲线程序。每个样品进行重复试验3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，假定扩增效率为100%，并假定标准曲线及每次扩增之间的效率保持一致，选取Elongation Factor1α(CmEF1α，KF305681)作为内参基因，采用2^-Ct法进行相对定量。

4.3.3载体构建

①得到目的基因全长序列后，对ORF框序列进行酶切位点分析，在起始密码子前加入BamH I酶切位点，在CmHRE2终止密码子前(不加终止密码子)加入Not I酶切位点，引物序列见表1。以含有CmHRE2基因的pMD19-T质粒为模板，进行高保真PCR扩增加了酶切位点的目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化并回收(附录4)。将纯化产物和入门载体pENTR1A质粒同时进行BamHI和Not I双酶切，37℃酶切2.5 h，具体反应体系如下：

②酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段。将纯化的CmHRE2片段分别与pENTR1A载体片段进行连接，16℃连接过夜，反应体系如下：

③转化大肠杆菌感受态，挑菌，摇菌，菌液检测，送测序。转摇，提质粒(水加30μL)

④构目的载体重组

——将入门载体单酶切(线性化)：

20 μL体系：dd H₂O 12 μL

Nsi I(或Dpn I) 1 μL

10X Fast Digest绿色缓冲液 2 μL

质粒 5 μL

程序：37 ℃，8h；70 ℃，10 min；4 ℃，∞

跑胶，(未切与已切同时跑胶，未切作为对照，看差别)，胶回收

——单酶切后与目的载体重组

5 μL体系：线性化产物 3 μL

空载体 1 μL

LR重组酶 1 μL

程序：25℃，1h；加 0.5μL Proteinase K；37℃，15 min；70 ℃，10 min；冰置3~5 min，转化大肠杆菌感受态(直接用PCR产物转化)，涂板，挑菌，摇菌，检测，送测序。

4.3.4亚细胞定位

洋葱处理：将洋葱表皮切成若干个1 cm2的小块，用无菌水浸泡，再用无菌滤纸吸干表面液体，将洋葱表皮贴在高渗培养基上培养一晚上，第二天将洋葱表皮转移到MS固体培养基上培养3-4h，用于基因枪轰击。

通过基因枪轰击法，将质粒转入洋葱表皮细胞，暗培养后在激光共聚焦下观察荧光发生部位，从而确定HRE2基因表达部位。

4.3.5转录激活活性分析

pGBKT7-X诱饵质粒的构建及自激活性的检测：

通过正反向引物对X两端加上合适的两个酶切位点(5’端防止移码) ，通过双酶切(Takara) 及连接构建pGBKT7-X质粒。

将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收后，进行目的片段与pGBKT7连接，连接体系同上。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂LB(Kan) 平板培养基，37℃过夜培养。将pGBKT7-X质粒与pAD空载共转化酵母菌株Y2H：

将热激转化后的酵母分别涂抹于不同的缺陷培养基上。pGBKT7载体作为阴性对照，而pCL1作为阳性对照。pGBKT7-CmHRE2和pGBKT7空载体涂抹在SD/-Trp培养基上，而阳性对照涂抹于SD/-Leu培养基上，30℃，倒扣培养2-4 d。然后把长出的酵母菌落转到SD/-His-Ade上进行筛选。30℃培养2 d，检查生长情况。而后，通过分段的方法把全长以及C端和N端部分序列构建到pGBKT7载体中然后转化到酵母菌株中，在缺His和Ade的培养基上确认各部分的转录激活活性。

4.3.6农杆菌转化菊花

(1以70 mmo/L CaCl2作为转化溶液,YEB培养基制备农杆菌感受态，用于后续质粒转化(朱锦辉等, 2006)。

(2质粒转化农杆菌感受态

①吸取构建好的表达载体质粒5 μl，加入到100 μl感受态细胞中，混匀；

②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37oC热击5 min；

③加入800 μl YEB液体培养基，28oC，200 rpm，摇床培养5 h；

④离心，留200 μl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基(含质粒对应的抗生素) 28oC培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70oC保存，用于下一步植物转化。

(3 叶盘法转化菊花‘神马’

①取25~30 d苗龄‘神马’无菌苗，用手术刀在无菌操作台中把无菌苗顶端叶片切成0.5 cm×0.5 cm的叶盘，置于预培养培养基中预培养2~3 d。

②然后浸入备好的农杆菌菌株的菌液(OD：0.5~0.6) 中感染10 min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再接种到共培养基上暗培养3 d，而后转入脱羧培养基上延迟培养5 d。

③转入选择培养基上继代培养3～4代，两周继代一次，逐渐降低筛选压。

④分化出的抗性芽长至2～3 cm时，将抗性芽转入生根筛选培养基上进行筛选，初步获得抗性植株。

⑤DNA鉴定抗性苗是否含有已转入的表达载体，RT-PCR鉴定抗性苗转入基因的表达量。最后对抗性苗进行炼苗移栽。将抗性株系移栽大田，越冬后取脚芽进行分子检测。

4.4技术路线

4.5可行性分析

指导老师课题组具有完备的以菊花为研究对象的分子生物学技术手段。在多种观赏园艺植物的分子生理方面展开了相关基础研究，实验室已成功克隆了‘菊花脑’CnHRE2全长，实验室提供完善的载体构建方法并且建立了成熟的菊花转基因技术体系，为本项目顺利开展提供了必要的技术支撑。在实验材料、实验时间、研究方法、依托条件和研究目标上都具有可行性。

实验材料：南京农业大学菊花种质中心保存的切花菊‘神马’，并且课题组实验室具有培养菊花幼苗和生长菊花植株的适宜条件。

实验时间：本项目多数为室内试验，不受季节等因素的影响，可利用课余时间进行试验分析，避免与学习时间冲突。

依托条件：本项目依托南京农业大学园艺学院公共平台、园艺学院菊花遗传育种与种质创新实验室，具备所需的仪器设备和雄厚的技术手段，具备完成本课题全部实验和数据分析的能力。

研究目标：本试验在研究目标上设定的难度适宜，试验是可行的。

4. 研究创新点

1）率先克隆菊花乙烯信号路径中基因CmHRE2，并解析其表达特性。

2）率先通过转基因手段鉴定CmHRE2抗蚜性功能。

5. 研究计划与进展

2018年3月-2018年4月 阅读相关文献，熟悉理论知识和掌握各类分子生物学实验技术；菊花实验幼苗扩繁

2018年4月~2018年5月 cmhre2基因全长序列克隆及其同源性分析；

2018年5月~2018年6月 表达载体构建；亚细胞定位和转录激活活性分析；