1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、研究意义
番茄（solanum lycopersicuml.或 lycopersicon esculentum mill.）属于茄科 （solanaceae）茄属（solanum），原产于南美洲安第斯山脉，是重要的世界性经济作物，广泛用于露地和设施栽培。番茄喜温但不耐高温，高温对其种子萌发、营养生长、生殖生长都有不良影响。随着全球气候变暖，高温胁迫愈发成为影响植物生长发育和作物产量的重要的非生物胁迫因子。
转录水平的调控是影响真核生物基因表达的主要环节，而转录活性与转录因子息息相关，植物响应非生物胁迫的过程往往受到多种类型转录因子的调控。因此，在植物中开展高温胁迫转录因子的筛选将有助于高温胁迫作用机理的解析，对培育耐高温性品种具有重要的理论意义与实践意义。gras转录因子是植物特有的转录因子，在多种植物中已有发现，如拟南芥、水稻、佛手、柑橘、番茄等（周莲洁等，2013）.该类转录因子的所有成员都具特有的gras结构，研究表明，gras转录因子与植物的生长发育、信号传导和逆境胁迫等方面密切相关。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究目标
本试验的研究目标是利用基因沉默技术，明确slgras4基因对番茄耐热性的调控作用。首先根据病毒诱导基因沉默技术，将番茄基因特异性片段构建到vigs干扰表达载体中，再通过侵染番茄幼苗植株叶片获得病毒侵染株系，通过热胁迫处理、复水后目的基因的表达特征以及生理指标变化，判断slgras4基因经vigs侵染后的沉默效果，阐明番茄slgras4基因在热胁迫条件下的应答机制，为耐热性作物品种改良提供有效的基因材料支持。
3. 研究的方法与方案
一、研究方法
利用数据库与在线网站完成GRAS转录因子家族中单个基因生物信息学研究与筛选；
通过穴盘育苗的方法培育番茄苗并完成基因沉默转化。
通过拍照的方法完成番茄表型的记录。
利用实验室仪器完成相对电导率、丙二醛含量、叶绿素含量、H2O2浓度以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD酶活的测定。
利用SPSS（6.1）统计软件进行相关的方差分析和差异性比较。
二、技术路线
三、实验方案
8.1基因筛选
样品处理和qRT-PCR验证：将五叶一心的耐热番茄“LA2093”幼苗置于40℃培养箱中进行热处理；在处理 0、4、8、12 和24h后，收集处理植株的叶片，放在-80℃超低温冰箱中保存。每个处理进行3次生物学重复，每次重复使用 5 株幼苗（热胁迫下的动态表达分析）。利用 Trizol 试剂盒提取各样品的总RNA，按照试剂盒说明书完成cDNA 的合成和纯化并进行qRT-PCR验证。
8.2单个基因生物信息学研究
8.2.1基因序列分析和结构特征
候选基因的基本特征如染色体定位、内含子数目、基因组序列、编码序列(CDS)、氨基酸序列等可以在NCBI数据库获得。利用在线网站Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)比对基因组DNA和全长CDNA得到内含子外显子结构图。
8.2.2蛋白结构预测和特性分析
蛋白结构域分析利用在线网站InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)。蛋白质二级结构预测利用UCL中的PSIPRED工具（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred），蛋白质三级结构预测利用在线分析工具SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）。蛋白质的分子量、等电点和不稳定指数（II；值40可认为蛋白质不稳定）等通过在线计算工具ProtParam(http;//web.expasy.org/protparam)获得。
8.2.3系统进化分析
将SlGRAS4序列通过NCBI数据库进行Blast比对分析，下载其他物种的同源蛋白序列。利用多序列分析工具DNAMAN8对该基因和其他物种来源的同源基因进行氨基酸序列分析，构建简单进化树。通过在线程序MEME(http://meme-suite.org)获得候选蛋白的保守基序。设置参数如下：位置分布－任意重复数，基序数目3，基序长度6~200个氨基酸。
8.2.4启动子区顺式作用元件分析
植物中存在许多受逆境胁迫诱导而表达的植物基因，其上游启动子调控着抗逆基因的表达。启动子是起始基因转录的一段DNA序列，同时也是基因表达调控的关键点。利用 PlantCare 数据库( http: / /bioinformatics．psb．ugent．be / webtools / plantcare / html / ) ，对SlGRAS4起始密码子上游 2000 bp 启动子区序列进行分析。
8.2.5基因表达分析和蛋白互作分析
利用在线软件http://bar.utoronto.ca对基因在植物体内不同器官表达丰度进行分析。利用在线工具string（http://version-11-0.string-db.org/cgi/input.pl）对SlGRAS4进行蛋白互作分析。
8.3表达载体构建
8.3.1基因的克隆
选择PBI121载体上的Xbal和Sma1两个酶切位点，TRV2载体上Xbal和Kpn1两个酶切位点，利用诺唯赞公司CE Design V1.04软件单片段克隆法给目的片段的正反向引物5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列从而设计引物。
8.3.2线性化载体制备
利用Xbal和KpnI内切酶对TRV2载体进行双酶切。
8.3.3重组和遗传转化
Clone Express II 重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol，最适插入片段使用量为0.06pmol（载体与插入片段摩尔比为1:2）。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适克隆载体使用量=[0.02x克隆载体碱基对数]ng
最适插入片段使用量=[0.04x插入片段碱基对数]ng
1、根据公式计算重组反应所需DNA量
2、于冰上配置以下反应体系
| 组分 重组反应 阴性对照 |
| 线性化载体 XuL XuL 插入片段 YuL 0uL 5xCE II Buffer 4uL 0uL Exnase II 2uL 0uL ddH2O to20uL to20uL |
3、使用移液器吸打混匀（请勿振荡混匀），短暂离心将反应液收集至管底。
4、37℃反应30min，降至4℃或至于冰上冷却。
重组产物转化大肠杆菌DH5a，测序正确后抽提质粒并转化到农杆菌GV3101，保存备用。
8.4基因沉默遗传转化
用55C°温水浸泡NT-186番茄种子，催芽3d后播于32孔的穴盘中，草炭：蛭石：珍珠岩=2:1:1混合作为培养基质。材料在光照培养箱中进行长日照培养( 14 h 光照/10h 黑暗) ，温度白天/黑夜为25℃/18℃，光照强度为30000Lux。生长至第一片真叶刚露头时开始侵染。
8.4.1番茄叶片的侵染
侵染菌液制备好后，用1ml注射器的针头在叶片上扎6-8小孔，注意不能扎通叶片，将上述准备好的 TRV-PDS 和 TRV-SLHsfA4c菌液，用1ml注射器注射进番茄叶片中，将接种后的幼苗于光照培养箱中温度白天/黑夜为22℃/18℃、湿度 75% 、光照强度为30000Lux，暗培养两天之后交替培养。
8.4.2沉默植株效果检测
PDS（Phytoene desaturase），八氢番茄红素脱氢酶（Gene Bank 登录号：NC_015440）是类胡萝卜素合成途径的关键酶，PDS 基因沉默后叶片会出现褪绿现象。所以将该基因作为指示基因，待接种 TRV-PDS 载体的植株叶片出现较明显白化现象后，进行热处理。
8.4.3沉默植株热胁迫处理
以转入TRV2空载体的植株为对照组，待TRV-PDS 植株白化比较完全时，对接种 TRV-SlGRAS4载体的植株和CK植株进行0、4、8、12、24小时热处理。
8.4.4表型差异分析
分别取6棵CK植株和沉默植株进行表型差异分析，在0小时的时候拍照记录，至沉默株系出现明显表型的时候再次拍照记录。
8.4.5生理指标测定
包括相对电导率、丙二醛含量、叶绿素含量、H2O2浓度以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD酶活的测定。取0、12、24小时叶片测定叶绿素含量、取0、4、8、12、24小时的叶片测定电导率、丙二醛、过氧化氢含量和基因表达量、取0、4和8小时的叶片测定酶活和过氧化氢染色，每个处理18株植物，测定各项生理指标均为4次重复。实验结果均为4次重复的平均值±SE。利用SPSS（6.1）统计软件进行相关的方差分析和差异性比较。
4. 研究创新点
一、特色或创新之处
目前在植物响应高温胁迫转录因子的研究中，对于热激转录因子 hsfs(heat shock transcription factors)的研究比较多也比较成熟。也有研究证明wrky转录因子，nac类转录因子，myb类转录因子，bzip类转录因子在对于植物响应高温胁迫时具有调控功能。但对于gras转录因子家族在耐热性方面的研究还比较少，在番茄方面则更少。本课题主要进行的便是gras转录因子在番茄耐热功能方面的验证。
5. 研究计划与进展
一、研究计划及预期进展
1、2019年4月-2019年6月，番茄种植以及热处理、qrt-pcr筛选基因、单个基因生物信息学分析、载体构建。
2、2019年8月-2019年12月，基因沉默遗传转化、生理生化指标测定。
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