黄瓜HMGR基因克隆及表达分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题的意义

黄瓜（2n14， cucumis sativus l.），为葫芦科黄瓜属植物，是一种世界性的蔬菜作物。黄瓜原产于热带亚地区，在中国各地普遍栽培。在近年来随着保护地栽培面积的增加以及生活质量的提高，人们对黄瓜生理特性也提出了较高的要求。植物中的倍半萜类生物碱是其主要有效成分之一，但含量一般较低[1]，因此通过基因工程手段提高倍半萜类生物碱的含量具有重大意义。

3-羟基-3-甲戊二酰-coa 还原酶( 3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme a reductase，hmgr)是植物萜类化合物甲羟戊酸合成途径中的关键限速酶[2]。植物倍半萜类物质生物合成中的c5单位主要来自甲羟戊酸( mva) 途径。mva途径是合成倍半萜的主要来源，两分子乙酰 coa( acetyl-coa)形成乙酰 coa( acetoacetyl-coa)，经催化形成 3-羟基-3-甲基戊二酰 coa( hmg-coa)，再逐步合成甲羟戊酸-5-磷 酸 ( mvap )、甲 羟 戊 酸-5-二磷酸( mvapp)及异戊烯基焦磷酸( ipp)，或其异构体二甲丙烯基焦磷酸( dmapp)［3］。fpp 为倍半萜的前体物质，经异构、环化、络合等方式最终形成倍半萜［4］。在 mva 途经中，hmgＲ被认为是 mva 途径中的关键限速酶之一［5］。大量研究表明 倍半萜类物质的合成与 hmgＲ 活性呈正相关，提高植物体内 hmgＲ 基因的表达水平可显著提高倍半萜类物质含量［6］。如 chappell 和 nable [7］通过外源真菌诱导烟草悬浮 细胞的 hmgr酶活性，进而促进了倍半萜类化合物 的积累。此外，甜椒 hmgＲ2 基因表达水平也受外 源真菌诱导，同时倍半萜环化酶及法尼基焦磷酸合酶的活性也随之提高，暗示 hmgＲ2 基因参与调控 甜椒倍半萜类化合物的生物合成［8］。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

本研究从倍半萜类生物碱生物合成途径出发， 采用 rt-pcr 结合 race 技术克隆得到黄瓜倍半萜类生物碱生物合成途径中的关键酶基因（hmgr）的全长 cdna， 并进行生物信息学和定量表达分析，希望为后续其hmgr 基因的功能验证以及倍半萜类生物碱合成代谢工程改良奠定基础。

3. 研究的方法与方案

研究方法

1. rna 的提取及 cdna 的合成

采用 tripure 法进行总 rna 的提取，提取得到的总 rna 经 1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经分光光度计检测其纯度。而后直接用于 cdna 第一链的合成或置于-80 ℃条件下保存备用。保守区扩增、3′race以及开放阅读框(orf)验证过程中所用的cdna 的合成都是采用revertaidtm first str cdna synthesis kit（fermentas）试剂盒， 5′race 所需 cdna 的合成 采 用 system f rapid amplification of cdna ends，version 2.0 的试剂盒进行，产物均置于-20 ℃保存。

4. 研究创新点

特色和创新之处：

萜类化合物在植物的生长发育过程中起着关键的作用，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a 还原酶（hmgr）在植物萜类的生物合成方面具有重要的调控作用。但目前还未有hmgr 基因从黄瓜中克隆得到的相关报道。本研究采用rt-pcr结合基因克隆技术首次克隆到黄瓜萜类生物碱生物合成途径中的关键酶基因（hmgr）的全长cdna，并对其进行生物信息学及表达分析，希望为后续黄瓜hmgr 基因的功能验证以及萜类代谢物合成代谢工程改良奠定基础。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2019年9-11月：种植黄瓜野生型品种“长春密刺”材料，并取其嫩叶、根、茎留样备用，并搜集相关文献材料；

2019年11-12月：提取长春密刺叶片总rna，并反转录为cdna，同时设计hmgr克隆引物、定量引物，并对其进行pcr扩增、qrt-pcr实时定量等实验以克隆hmgr基因，分析表达模式；