萝卜水通道蛋白PIP基因克隆及过表达载体的构建开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

萝卜在中国的栽培分布广，品种多，栽培面积一直保持在蔬菜中的前三甲，是中国重要的蔬菜之一，但是与之形成鲜明对比的是耐盐萝卜品种在市场上几乎没有，制约了萝卜产业的发展，所以研究萝卜耐盐逆境响应是很有必要的。

质膜内在蛋白(pips)是水通道蛋白的一种，因其定位在质膜上，介导了植物体细胞间的水分运输。在大豆、水稻等作物中己有关于pips基因的克隆和序列分析等相关研究。本试验采用rt-pcr技术，克隆得到全长的萝卜pip家族基因，并对其序列进行比对分析，为进一步研究该基因功能打下理论基础。

2. 研究的基本内容和问题

1.1 研究目标

(1) 克隆出pip 家族基因，分析pip蛋白的理化性质。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

基因克隆技术、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)。

2.技术路线图：

3.实验方案

（1）总RNA的提取采用改进快速CTAB法, 用DNase I进行纯化。然后用Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白测定仪测定RNA含量, 1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

（2）根据GenBank登录的PIP基因的保守序列设计上、下游引物S1和A1。以萝卜根系的 cDNA为模板, 扩增RtPIP片段。在20 μL反应体系中进行PCR扩增, 扩增程序为: 95°C预变性5 min; 95°C变性45 s, 56°C退火50 s, 72°C延伸1 min, 35个循环; 72°C延伸10 min; 4°C保存。

（3）PCR产物的纯化与测序。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 切取目的条带, 回收、纯化后, 连接到pMD18-T克隆载体上, 用热激法导入到DH5α感受态细胞中, 进行 Amp抗性筛选, 挑选白色菌落, 提取质粒, 经PCR和酶切鉴定后, 将阳性重组质粒送公司测序。

（4）生物信息学分析。用DNAMAN软件预测氨基酸序列并进行氨基酸同源性分析。将核苷酸及氨基酸序列提交至 NCBI进行BLAST分析, 检索该基因与其他物种的同源性。

（5）基因表达分析。使用Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪, 采用实时 荧光定量PCR (qRT-PCR)对PbPIP1的表达量进行 分析, 利用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。反应体系为20 μL。反应程序: 95°C预 变性30 s; 95°C变性5 s, 55°C退火35 s, 72°C延伸30 s, 40个循环, 同时在60~95°C进行融解曲线分析。每个样品进行3次重复。

4.可行性分析

本实验室为我国最早开展萝卜种质资源与遗传改良研究单位之一，也是作物遗

传与种质创新国家重点实验室的重要组成部分。本实验室从事萝卜遗传育种工作几

十年，收集培育了丰富的萝卜种质资源，并构建了萝卜种质基因库信息系统。试验

场、温室设施完备，拥有良好的育苗条件，能根据需要开展相应的育苗实验工作；

基地土壤气候环境适宜，能保证萝卜的良好生长；仪器设备齐全，能满足本实验所

需。以及长期与其他相关实验基地、实验点及农科院等组织机构密切交流合作。通过掌握的资源以及经验，能够高效进行萝卜PIP基因的找寻以及生物学功能分析。

4. 研究创新点

通过掌握的资源以及经验，能够高效进行萝卜PIP基因的找寻以及生物学功能分析。

5. 研究计划与进展

1）研究计划：

2019.03-2019.04