1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、研究目的和意义
菊花，作为我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有很高的观赏和经济价值。菊花在花卉生产中占有重要地位，主要应用方式有切花、盆栽、园林地被。生产上多采用设施栽培进行切花菊周年生产。在菊花生产栽培过程中，容易受到各种非生物和生物胁迫，如降雨、低温和蚜虫等胁迫，从而影响菊花的品质。特别是蚜虫会严重影响菊花的生长发育，导致菊花的品质下降。蚜虫胁迫已经成为限制我国菊花产业发展的重要因素。蚜虫是地球上最具破坏性的害虫之一，繁殖力很强，一年能繁殖10～30个世代，时代重叠现象突出。且雌性蚜虫不需要雄性，一生下来就能够生育。蚜虫带刺吸的小口针能刺穿植物的表皮层，吸取养分。还会分泌含有糖分的蜜露。排泄的蜜露一方面吸引蚂蚁前来取食，另一方面影响植物正常的光合作用。此外，由于蚜虫迁飞扩散寻找寄主植物时要反复转移尝食，所以可以传播多种植物病毒病，给植物造成更大的危害。菊花蚜虫主要分布于菊花叶背和花蕾，使叶片皱缩反卷，花朵变小或减少，严重影响到菊花的品质。因此利用分子生物技术培育具有优良抗性的菊花新品种，是现代化育种的重要方向，也对解决生产实际问题和菊花产业的发展有着重要的意义。
myb 转录因子是一种螺旋-转角-螺旋蛋白，是植物中最大的转录因子家族之一，在不同的生物过程中发挥着特殊的作用，包括调控植物生长发育及形态建成、调节初级和次生代谢、种子和花的发育、细胞分化、防御、响应生物和非生物胁迫等。植物类黄酮通过参与级联信号反应能发挥其自身的特异性，有效提升植物抵御外界恶劣条件。myb 转录因子广泛的参与了类黄酮代谢途径。菊花里cmmyb111基因对蚜虫抗性的具体作用还没有被详细阐明，克隆cmmyb111基因并对功能进行鉴定有利于进一步完善菊花蚜虫抗性机制和种质改良具有重要的意义。
2. 研究的基本内容和问题
三、研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.研究目标
3. 研究的方法与方案
四、试验设计
1.研究材料
南京农业大学菊花种质中心保存的切花菊‘神马’。
2.研究手段
高保真PCR方法克隆CmMYB111全长，使用荧光定量方法进行表达特性分析，构建植物表达载体和酵母表达载体进行亚细胞定位和转录激活活性分析。利用农杆菌侵染法转化‘神马’并进行转基因鉴定，分析转基因株系对蚜虫胁迫的抗性。
3.研究方法
3.1 高保真PCR
①根据转录组拼接结果设计CmMYB111全长引物，以第一链cDNA为模板，进行高保真PCR扩增以检测序列的可靠性。高保真酶反应体系与程序如下：
1）反应体系50 μl ：
| 5×Phusion HF | 10μl |
| dNTPs Mixture (10 mM) | 1.0μl |
| 上游引物 下游引物 | 1.0μl 1.0μl |
| DMSO | 1.5 μl |
| cDNA | 1.0μl |
| Phusion DNA Polymerase | 0.5 μl |
| ddH2O | 34 μl |
| Total | 50 μl |
2）反应程序：98℃ 30 sec; 98℃ 10 sec, 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec/1 kb, 30 个循环；72℃ 7min；4℃保温；
② 将高保真PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取特异性条带进行切胶、纯化；
③ 1）将上述步骤②中的纯化片段进行加A尾，体系如下：
| 10×PCR Buffer | 2.5μl |
| Mg2 (25 mM) | 1.5μl |
| dNTPs Mixture (2.5mM) | 2.0μl |
| 切胶、纯化片段 | 18 μl |
| rTaq (5U/μl) | 1.0μl |
| Total | 25 μl |
混匀，离心，72℃保温30 min；
2）将A尾产物再进行纯化，所使用的纯化试剂盒是：TaKaRa DNA Fragment Purification kit Ver.4.0。
④ 将上述步骤3中的纯化产物进行连接、转化、测序。
3.2荧光定量（qPCR）
每20 μl qPCR反应液中包含10 μl SYBR Green PCR master mix，上、下游引物各0.5 μM以及10 ng cDNA。加样体系如下：
| SYBRPremix Ex TaqTMII | 10.0 μl |
| Forward primer （10 μM） | 1.0 μl |
| Reverse primer （10 μM） | 1.0 μl |
| cDNA template | 5.0 μl |
| RNase Free dH2O | 3.0 μl |
| Total | 20.0 μl |
把荧光定量板置于Mastercycler ep realplex 2 S（Eppendorf，德国）定量PCR仪中，设定荧光采集通道以及读取荧光步骤，PCR反应按照以下反应程序进行：95℃2 min；95℃15 s，55℃15 s，72℃20 s，40个循环；最后加入溶解曲线程序。每个样品进行重复试验3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，假定扩增效率为100%，并假定标准曲线及每次扩增之间的效率保持一致，选取Elongation Factor1α（CmEF1α，KF305681）作为内参基因，采用2-Ct法进行相对定量。
3.3 载体构建
得到CmMYB111的全长序列后，对ORF框序列进行酶切位点分析，在起始密码子前加入BamH I酶切位点，在CmMYB111终止密码子前（不加终止密码子）加入NotI酶切位点，引物序列见表1。以含有CmMYB111基因的pMD19-T质粒为模板，进行高保真PCR扩增加了酶切位点的目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化并回收（附录4）。将纯化产物和入门载体pENTR1A质粒同时进行BamHI和NotI双酶切，37℃酶切2.5 h，具体反应体系如下：
| Plasmid/ PCR DNA | 1.0 μg |
| BamH I | 2.0 μl |
| NotI / XhoI | 2.0 μl |
| 10×Buffer | 4.0 μl |
| ddH2O | up to 40.0 μl |
| Total | 40.0 μl |
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段。将纯化的CmMYB111片段分别与pENTR1A载体片段进行连接，16℃连接过夜，反应体系如下：
| 目的基因片段 | 2.0 μl |
| pENTR1A载体 | 0.5 μl |
| Solution I | 2.5 μl |
| Total | 5.0 μl |
将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，LB/Kan筛选培养基37℃过夜培养，菌液检测，挑选阳性菌液送公司测序。将pENTR1A-CmMYB111质粒用限制性内切酶PvuI（NEB，美国）进行单酶切线性化，反应体系如下：
| 10×Buffer | 5.0 μl |
| Plasmid | 2.5 μg |
| PvuI | 2.5 μl |
| ddH2O | up to 50.0 μl |
| Total | 50.0 μl |
37℃酶切2h，酶切产物琼脂糖电泳检测，切胶回收线性化pENTR1A- CmMYB111质粒片段。将亚细胞定位表达载体pMDC43分别与线性化pENTR1A-CmMYB111质粒进行LR重组，反应体系如下：
| 线性化入门载体 |
| 25-75 ng |
| pMDC43 |
| 75 ng |
| LR Clonase II enzyme mix |
| 1μl |
| TE buffer（pH 8.0） |
| up to 4.0 μl |
| Total |
| 5.0 μl |
25℃反应5h，将重组产物转化DH5α感受态细胞，37℃筛选培养基LB/Kan过夜培养，经菌液PCR检测后挑选阳性菌液送测序。
3.4 亚细胞定位
将保存在-80冰箱的pMDC43-CmMYB111转化到GV3101菌株的农杆菌和p19和35S::D53-RFP转化到农杆菌的菌株在YEB加了卡那霉素和利福平的培养基上提前活化划线，挑取单克隆在YEB加了抗生素液体培养基里摇菌，OD值达到0.8-1.5时把三种菌液按比例混合注射到烟草叶片中，35S::GFP空载菌液作为对照以同样的方法注射到烟草细胞，在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号和拍照（LSM800,Zeiss）。
3.5转录激活活性分析
利用酵母转化试剂盒MatchmarkerTM Yeast Transformation System 2（Clontech），分别将pGBKT7-CmMYB111、阴性对照pGBKT7和阳性对照pCL1转化到酵母Y2H感受态中，pGBKT7- CmMYB111、阴性对照pGBKT7涂布于SD/-Trp培养基，转阳性对照pCL1的酵母菌液涂于SD/-Leu培养基。30℃倒置培养3 d，挑取单克隆划线到SD/-Ade/-His并加了X-α-gal培养基上培养，继续30℃倒置培养并观察菌落生长状况，拍照。
3.6农杆菌转化菊花
3.6.1农杆菌感受态制备
①从YEB平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5 mL YEB (含50 μg/mL 利福平) 液体培养基中，28oC，200 rpm，过夜培养；
②取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28oC，200 rpm，摇床培养至OD达到0.5；
③菌液冰浴30 min，转至预冷的50 mL离心管中离心10 min (4oC，5000 rpm) ，收集菌体；
④2 mL预冷的50 mM 无菌CaCl2溶液 (含15%甘油) 悬浮菌体，即为感受态细胞；以100 μl/管分装，液氮速冻后，保存于-70oC冰箱，备用。
3.6.2质粒转化农杆菌感受态
①吸取构建好的表达载体质粒5 μl，加入到100 μl感受态细胞中，混匀；
②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37oC热击5 min；
③加入800 μl YEB液体培养基，28oC，200 rpm，摇床培养5 h；
④离心，留200 μl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基(含质粒对应的抗生素) 28℃培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70℃保存，用于下一步植物转化。
3.6.3叶盘法转化菊花‘神马’
①取25~30 d苗龄‘神马’无菌苗，用手术刀在无菌操作台中把无菌苗顶端叶片切成0.5 cm×0.5 cm的叶盘，置于预培养培养基中预培养2~3 d。
②然后浸入备好的农杆菌菌株的菌液(OD：0.5~0.6) 中感染10 min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再接种到共培养基上暗培养3 d，而后转入脱羧培养基上延迟培养5 d。
③转入选择培养基上继代培养3～4代，两周继代一次，逐渐降低筛选压。
④分化出的抗性芽长至2～3 cm时，将抗性芽转入生根筛选培养基上进行筛选，初步获得抗性植株。
⑤DNA鉴定抗性苗是否含有已转入的表达载体，qPCR鉴定抗性苗转入基因的表达量。最后对抗性苗进行炼苗移栽。将抗性株系移栽大田，越冬后取脚芽进行分子检测。
4.技术路线
5.可行性分析
供试切花大菊品种‘神马’保存在南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”，用于CmMYB111的克隆，组织定量和蚜虫处理。实验室菊花‘神马’转录组库有CmMYB111拼接全长，实验室建立了完善的菊花载体构建，定量表达分析，亚细胞定位和转录激活活性分析的实验方法并且提供试剂和仪器，为本项目顺利开展提供了必要的技术支撑。
实验材料：南京农业大学菊花种质中心保存的切花菊‘神马’，并且课题组实验室具有培养菊花幼苗和生长菊花植株的适宜条件。
实验时间：本项目多数为室内试验，不受季节等因素的影响，可利用课余时间进行试验分析，避免与学习时间冲突。
依托条件：本项目依托南京农业大学园艺学院公共平台、园艺学院菊花遗传育种与种质创新实验室，具备所需的仪器设备和雄厚的技术手段，具备完成本课题全部实验和数据分析的能力。
研究目标：本试验在研究目标上设定的难度适宜，实验可行。
4. 研究创新点
6.特色或创新之处
1）率先克隆菊花乙烯信号路径中基因cmmyb111，并解析其表达特性；
2）率先通过转基因手段鉴定cmmyb111抗蚜性功能。
5. 研究计划与进展
五、进度安排
2018. 9 -2018.10 cmmyb111基因全长序列克隆分析；
2018. 11 - 2018. 12 表达载体构建；亚细胞定位和转录激活活性分析；
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