1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）
胡萝卜（Daucuscarota L.）是伞形科（Apiaceae）二年生草本植物，肉质根是其主要的食用部位[1]。胡萝卜含有丰富的营养成分，是一种重要的根菜类蔬菜作物，其种质资源丰富[2]。在我国，胡萝卜已有好几百年的栽培历史，南北各地均有栽培，特别是我国北方气候冷凉的地区，种植面积很大[1]。 植物生长的环境中经常存在着各种各样的逆境胁迫，比如干旱、低温、高温、盐，是限制产量的主要因素。高浓度的盐会引起植物体内高渗透胁迫或者离子分布不平衡，进一步可能会产生氧化损伤[3]。植物有对于逆境胁迫的抵抗或者适应的能力，叫做抗逆性。植物的抗逆性有时会表现在生理上的适应性[4]。胡萝卜在面临非生物胁迫时，会启动相关系统的诸多基因表达调控进程，诱导相关转录因子激活表达，逆境响应基因的表达会诱发植物体做出各种生理反应来减弱逆境所致的影响[5]。所以，探讨胡萝卜逆境的转录因子是一个重要的课题，不仅能够增加抗逆的理论基础，也能作为提高胡萝卜产量和种植范围的依据。
1 转录因子家族 基因表达的转录调控在植物对环境的适应和抗逆境胁迫中起着重要的作用[6]。转录调控是指通过转录因子作为反式作用因子与对应的顺式作用元件特异性结合来适应逆境的调控手段[7]。转录因子是一种调节基因表达水平的调控基因，通过与靶基因启动子中特定的DNA序列结合，激活或抑制靶基因的转录表达[6]。顺式作用元件是与转录因子结合的一段长5-20个碱基对的序列[8]。通过不断合成转录因子，将逆境的信号传递、放大，调节下游基因的表达，引起生理生化变化[9]。与植物逆境相关的主要转录因子有如下八个家族， DREB、MYB、MYC、ABREs、GCC-box、WRKY、G-box、NAC[8]。
2 ABF转录因子 ABF转录因子是bZIP转录因子的A亚族，特异存在于植物中。ABF代表ABRE bindingfact，被称为ABRE结合因子，ABRE代表ABA-responsiveelement ，被称为ABA响应元件结合因子[10-12]。2000年，Choi等在胁迫条件下，从拟南芥中分离出ABRE结合因子家族，从原型ABRE分离并命名ABFs转录因子[13]。ABF转录因子能够调控植物的生长发育，增强植物对干旱、盐、低温的适应能力[10-13]。ABF转录因子在结构上具有5个保守结构域，C端有1个结合DNA的bZIP区域和1个末端C4保守结构，N端有3个保守结构(C1、C2和C3)[14]。N端有酸性激活区，以二聚体形式结合DNA，肽链的N端碱性区可直接结合DNA[12]。ABF转录因子识别的核心序列是ACGT顺式作用元件，如TACGTA（A盒）、GACGTC(C盒)、CACGTG(G盒)[15-16]。部分ABF转录因子含有脯氨酸、谷氨酰胺及酸性氨基酸的结构域，这可能与调控下游基因表达有关[17]。研究表明，拟南芥中ABF蛋白家族由4个成员组成，即AREB1/ABF2、AREB2/ABF4、ABF1和ABF3。在这四个成员中，ABF1主要受渗透胁迫诱导[18]、低温胁迫诱导[12]。 干旱、盐等非生物胁迫是通过包含ABF在内的cis元件诱导基因的表达[19]。许多干旱胁迫应答基因受到ABA的诱导，在植物种子发育或水分缺少时，内源ABA含量大大增加[20]。ABF能激活含有ABRE元件的基因的表达[12,21]。ABA引发AREB磷酸化作用，磷酸化作用是AREB诱导下游基因的必要条件之一，发生在保守域的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点上，激酶磷酸化激活bZIP蛋白，bZIP蛋白结合到基因的启动子区ABRE作用元件上[19]。且bZIP基因具有组织表达特异性[22]。 1991年，ABF转录因子在烟草中被报道[23-24]。2010年，PtrABF在转基因植株中的异位表达增强了植株抵抗干旱的能力，活性氧积累量降低，抗氧化酶表达量升高[25]。2015年，魏明等研究发现PtAREB9启动子受到SA响应元件调控能响应干旱、盐胁迫[26]。
3 NAC转录因子 NAC转录因子是指包含NAC 结构域的蛋白质。NAC 结构域是在矮牵牛 (Pharbifis nil)NAM、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) ATAF1/2 和CUC2 基因中发现的，是基因编码的一段约150个氨基酸的保守结构域[27]。NAC的结构域分为A、B、C、D、E五个亚结构，其中A、C、D在各种物种中都是高度保守的[28-29]。NAC的结构域是一个对称的同型二聚体，两个单体通过氢键或盐桥形成二聚体，二聚体表面的一侧含有大量正电荷[30-32]。NAC转录因子的C端为转录调控区，该区域具有转录激活功能且高度变异[33-35]。一些氨基酸在该区重复出现的频率较高，如脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸[30]。 在拟南芥的全基因组中找到至少13个NAC基因成员，它们具有跨膜功能[36]。这13个转录因子表达后被运输到质膜上，在膜上受到刺激后被释放并转移到细胞核中发挥调节功能[37-38]。NAC转录因子可以通过与其他蛋白相互作用来调控下游基因表达。拟南芥中ANAC019、ANAC055、ANAC072/RD26与锌指蛋白ZFHD1直接相互作用，激活下游基因表达[39]。在应对干旱中，脱落酸(ABA)是参与植物应对逆境胁迫的重要激素[40]。大部分被报道的具有耐寒性的NAC转录因子是由ABA诱导处理的。在拟南芥中被报道的基因有ANAC002、ANAC019、ANAC055、ANAC062、ANAC072[36,40-42]。 在拟南芥中，使用酵母单杂技术分离出三个NAC基因（ANAC019、ANAC055、ANAC072），它们能和含有CATGTG的启动子结合，超量表达后能显著提高植株的抗旱能力[40]。水稻中的研究表明，过量表达的NAC基因可以促进叶片气孔关闭、减缓水分散失、增加抗旱能力[43]。水稻中的SNAC1基因在受到干旱胁迫时可以促进气孔关闭，同时不影响光合速率，极大增强抗旱性[43]。水稻中的SNAC2基因在受到干旱、盐、低温等逆境胁迫时，能够正向调控很多抗逆相关的基因表达，如热激蛋白、过氧化物酶[44]。 第一个NAC转录因子是由Souer等人发现的[45]。2014年，Mao Xinguo等在拟南芥中，过表达TaNAC67基因，发现植株对于干旱、盐、低温的耐受能力显著提高，并且拟南芥的正常生长没有受到任何不良影响[46]。2018年，徐小艳等通过遗传转化获得NtNAC1转基因烟草，发现转基因植株NtNAC1的表达量高于野生型，在干旱胁迫下，转基因植株的根系长于野生型[47]。2018年，段奥其等利用荧光定量PCR分析，得出AgNAC1基因在芹菜的叶片中表达量最高，对逆境（干旱、盐、高温、低温）均有响应[48]。
4.胡萝卜基因组 随着人们不断对胡萝卜进行研究，胡萝卜在基因组方面的研究已经有了很大的进展。1990年刘育乐等提取了胡萝卜核DNA[49]。2002年，齐眉等构建了胡萝卜体细胞胚的cDNA-AD融合表达文库[50]。2002年，Gibberd等研究发现盐胁迫会影响胡萝卜叶片的气体交换，导致光合能力显著下降[51]。2004年，Kumar等第一次利用非绿色植物组织作为外源DNA受体，通过体细胞胚胎发生途径完成质体转化，获得高水平耐盐性植株[52]。2016年，胡萝卜基因组发表，是伞形科首个完成全基因组测序的物种，测序质量较高，有很大的研究价值，为未来的实验提供了理论基础[53]。 一系列的研究表明，转录因子在植物抗逆中起到重要的正向调节作用。同时，植物激素可以调节转录因子的表达，这为我们从遗传上保证胡萝卜良好生长提供了重要的理论基础和应用意义。胡萝卜的健康生长与经济利润密切相关，开展胡萝卜抵抗逆境能力相关基因的研究对于利用基因手段提高胡萝卜产量、扩大胡萝卜栽培面积起到促进作用。
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2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题
研究目标
一、胡萝卜ABF转录因子基因DcABF1的克隆与非生物胁迫应答分析 从胡萝卜的cDNA中克隆得到DcABF1基因，对其进行生物信息学分析，并利用荧光定量PCR技术分析该基因在胡萝卜中的表达特性，为进一步研究胡萝卜抵抗非生物胁迫的途径提供实验基础。利用转录组和基因组数据库对胡萝卜中的NAC家族转录因子成员进行了鉴定。并且进行多重序列比对，预测和分析DcNAC蛋白的保守域、系统发育树和相互作用网络。
二、胡萝卜中的NAC家族转录因子基因组和转录组分析及对非生物胁迫的响应 在胡萝卜的生命周期中，NAC家族转录因子几乎参与了所有的生理过程。NAC转录因子在胡萝卜中的作用尚不清楚。本研究利用转录组和基因组数据库对胡萝卜中73个NAC家族转录因子成员进行了鉴定并分成了14个亚家族。我们进行了多重序列比对，蛋白保守域、共同基序、系统发育树和相互作用网络分析。
研究内容（同实验方案） 一、胡萝卜ABF转录因子基因DcABF1的克隆与非生物胁迫应答分析 胡萝卜材料‘君川红’于2018年4月种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。将2月龄胡萝卜植物进行如下处理：高温 (38 ℃)、低温 (4 ℃)、高盐 (0.2mol L-1 NaCl)、干旱 (200 g L-1 PEG)，处理时间为1、2、4、8和24 h，每个处理进行3个生物学重复。处理后取叶片样品，用锡纸包裹并迅速用液氮冷冻，在- 80 ℃下保存，用于提取总RNA。
使用RNA提取试剂盒（RNA simple total RNA Kit，北京Tiangen公司）分别提取经过不同处理胡萝卜叶片样品中的总RNA。提取完成后，利用反转录试剂盒（Prime Script RT Reagent Kit，大连TaKaRa公司）将提取的胡萝卜叶片总RNA反转录成cDNA。
根据胡萝卜转录组数据和基因组数据库（Wang et al.,2018；Xu etal., 2014；Iizzo et al., 2016），检索获得胡萝卜中编码ABF转录因子的基因DcABF1，利用PrimerPremier 6.0设计一对引物，正向引物为5-CGGATAGCTTGCAGCAGCAGAT-3，反向引物为5-ACTCTAGCCCCATCAATTCACC-3。以胡萝卜‘君川红’叶片cDNA为模板，使用20 μL体系进行PCR扩增。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。利用1.2 的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分离，对目的条带回收后连接到pMD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α，然后提取质粒进行鉴定，南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.3 序列分析 在BioXM2.6中获得DcABF1编码的氨基酸序列，在NCBI数据库中用BLAST工具获得不同物种ABF氨基酸序列并进行对比，在DNAMAN6.0软件中构建多序列比对图，并获得蛋白质亲疏水性图。利用MEGA 7.0软件构建系统进化树（Kumar et al., 2016），通过ExPASy-ProtParam（http//www.expasy.g）（黄蔚等2014）和在线工具SMS分析蛋白质相对分子质量、氨基酸构成成分和理论等电点。使用FoldIndex在线软件进行无序化分析，通过SOPMA在线软件预测及分析胡萝卜DcAEF1转录因子蛋白的二级结构，用Swiss-Model建立三级模型。采用MEME软件获得胡萝卜AREB/ABF蛋白的保守模块。利用PlantCARE数据库中进行启动子序列分析。
1.2.4 实时定量PCR反应 实时定量PCR反应采用Real-Time PCR检测系统。选用胡萝卜Actin基因作为内参基因（Tian et al., 2015）。正向引物为5-CGGATAGCTTGCAGCAGCAGAT-3，反向引物为5-ACTCTAGCCCCATCAATTCACC-3。DcABF1基因表达检测引物的正向为5-CAATGGTGGATATTATGGTGAG-3，反向为5-TACAGTTGCTTGTTTGGGGAAA-3。按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒 (大连TaKaRa公司) 的操作要求完成。使用体系为20 μL，每个体系含10μL SYBR Green I mix、0.4 μL正反向荧光定量引物、2.0μL cDNA、7.2 μL ddH2O。在Excel软件中分析不同组织内的表达水平。使用公式2-ΔΔCT转换为相对转录值（Pfaffl,2001）。相对定量方法使用ΔΔCT法，表达差异等于2-ΔΔCT，其中ΔCT＝CT目标基因-CTActin。
二、胡萝卜中的NAC家族转录因子基因组和转录组分析及对非生物胁迫的响应 胡萝卜的种子’黑田五寸’和’君川红’浸泡在蒸馏水中。0.5h后，种子在垫了滤纸的塑料培养皿中发芽，滤纸已在25℃蒸馏水中浸泡2天。试验在南京农业大学作物遗传与种质改良国家重点实验室进行。实验样品在控制环境生长室中，在黑暗16℃下生长8小时，在25℃下300 μmol·m-2·s-1光照强度和相对湿度为75光照下生长16小时。花盆的上部直径25cm，高度20.5cm。使用的土壤是土壤、珍珠岩和蛭石（211）（体积比）的混合物。 以2月龄胡萝卜植株为试验材料。根长5cm，株长38cm。在相同光照强度和日长条件下，将胡萝卜植株移栽到4℃作为低温胁迫处理。将胡萝卜植株移栽到38℃作为热胁迫处理。200 g·L-1 PEG 6000作为干旱胁迫处理，0.2 mol·L-1 NaCl作为盐胁迫（Chen et al.,2015; Huang et al., 2015; Li et al., 2015; Ma et al., 2019）。400毫升溶液一次性处理胡萝卜根。处理后1、2、4、8、12小时采集胡萝卜样品。样品立即在液氮中冷冻，在提取RNA之前保存在-80℃。
所有拟南芥NAC序列均从TAIR数据库（http//www.Arabidopsis.g）下载。利用拟南芥NAC转录因子的氨基酸序列鉴定DcNAC蛋白。所有胡萝卜NAC序列均从CarrotDB：胡萝卜基因组和转录组数据库（http//apicae.njou.edu.cn8080/CarrotDB）下载（Xu etal., 2014b）。利用NCBI的保守结构域数据库（http//www.NCBI.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对DcNAC蛋白的保守结构域进行了检索。序列被提交到BioXM 2.6进行开放阅读框架（ORFs,open reading frames）预测。
使用MEGA7.0的自举方差估计方法以及p-距离模型（1000个自举重复）构建了系统发育树（Kumar et al., 2016）。用DNAMAN 6.0软件完成了NAC结构域的多序列比对。DcNAC蛋白保守基序由MEME程序（http//MEME.nbcr.net/MEME/）鉴定（Bailey等人，2009）。所有基序的宽度都在50到200之间。利用专家蛋白质分析系统程序（http//web.expasy.g/translate/）（Gasteiger et al., 2003）计算了推导的DcNAC蛋白质的分子量（molecularweight, MW）和理论等电点（isoelectric point, pI）。利用序列操作套件（Sequence Manipulation Suite, SMS）网站（http//www.bio-soft.net/SMS/）分析DcNAC蛋白的理化性质。利用STRING软件整合蛋白质网络，置信参数设定为0.15（Franceschini et al., 2013）。利用Cluster 3.0程序和Excel分析了四个发育阶段（播后22、40、56和95天）的DcNAC基因表达簇（Wang et al., 2015a）。根据RPKM（reads per kilobase per million mappedreads, RPKM）估计胡萝卜中的基因表达（Franceschini et al., 2013）。用CIROS分析DcNAC蛋白的分布。通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi和http//itol.embl.de/upload.cgi绘制了陆地植物中NAC转录因子家族图。HMMER软件套件用于快速搜索广泛的序列数据库，允许用户通过域模式或分类法查看和筛选重要的搜索结果。HMMER软件网站是http//www.ebi.ac.uk/Tools/HMMER，使用默认参数（Finn et al.,2011; Potter et al., 2018）。
利用全RNA试剂盒（中国北京天根RNA简易全RNA试剂盒）从胡萝卜中提取总RNA再用DNaseⅠ（大连塔卡拉）处理以消除基因组DNA污染。利用PrimeScript-RT试剂盒（大连塔卡拉）将RNA反转录成cDNA。
根据预测的高表达丰度，从每个NAC亚家族中筛选出8个基因（DcNAC7、DcNAC13、DcNAC15、DcNAC20、DcNAC24、DcNAC25、DcNAC63、DcNAC65）进行RT-qPCR分析，以检测胡萝卜NAC基因对非生物胁迫的响应。Primer Premier 6.0用于设计所选DcNAC基因的引物。在Genscript公司（中国南京）合成了特异性引物。用独立生物RNA样品重复了三次实验。每一个生物学重复包含10个胡萝卜植株。RT-qPCR采用iQTM5 RT PCR系统和SYBRPremix Ex Taq（中国大连塔卡拉）进行。操作如下：95℃持续30s，95℃持续5s（40个循环），60℃持续30s，熔化曲线分析（65℃-95℃），每隔5s增加0.5℃。反应体积体系包括0.4μL正向引物、0.4μL反向引物、10μL SYBR预混物Ex-Taq、7.2μL ddH2O、2μL稀释cDNA。DcNAC基因的相对表达水平与DcActin基因的表达水平正常化（Tian et al., 2015; Wang et al., 2015b）。用2-ΔΔCT法测定胡萝卜候选DcNAC基因的相对表达水平（Pfaffl,2001）。
采用社会科学统计软件包（SPSS）17.0对数据进行显著性水平为0.05的分析。采用Duncan多程检验，以0.05的概率分析平均数和显著性差异（P0.05）。
拟解决的关键问题 通过本实验室胡萝卜转录组数据的检索获得DcABF1基因序列和NAC转录因子家族； 设计一对精确有效的上游引物； 利用各类软件进行基因序列的生物信息学分析。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1）研究方法 （1）根据老师推荐的相关文献，熟悉关于转录因子家族、基因分离与表达的知识。在老师的指导下，掌握相关分子生物学软件的使用，相关仪器的使用，相关实验操作和实验数据的采集与分析。 （2）利用公共数据库的序列进行比对来进行功能注释，进行功能预测。 （3）采用PCR的方法，从胡萝卜的cDNA中克隆基因。
2）技术路线与实验方案 从胡萝卜的cDNA中克隆得到DcABF1基因，对其进行生物信息学分析，并利用荧光定量PCR技术分析该基因在胡萝卜中的表达特性。 利用转录组和基因组数据库对胡萝卜中NAC家族转录因子成员进行了鉴定并分成亚家族。进行了多重序列比对，蛋白保守域、共同基序、系统发育树和相互作用网络分析。
3）可行性分析 本项目是基于指导老师及其所在课题组多年的研究工作基础上提出的，在实验材料、实验时间、研究方法、依托条件和研究目标上具有可行性。 实验材料：南京农业大学的作物遗传与种质创新国家重点实验室保存有多种胡萝卜种子，并且课题组实验室具有栽培和生长的适宜条件。 实验时间：本项目多数为室内试验，不受季节等因素的影响，可在预期的时间内完成。 依托条件：项目组依托南京农业大学园艺学院公共平台、国家重点实验室公共平台、教育部园艺作物种质创新与利用工程研究中心，具备较全面的仪器设备和雄厚的技术手段，具备完成本课题全部实验和数据分析的能力。 研究目标：本项目在研究目标上设定的难度适宜，是可行的。
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4. 研究创新点
1) 研究胡萝卜ABF、NAC转录因子对于提高胡萝卜植株抵抗逆境的能力，指导从遗传上保证胡萝卜种苗质量，提高胡萝卜品质和产量，提高经济利润有重要的意义。
2)本项目通过对两种转录因子的分析，结合胡萝卜相关基因的克隆、分析、表达研究，能够获得较为详实的不同的胡萝卜的转录因子表达情况。
5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 2019年5月 以胡萝卜君川红和黑田五寸为植物材料，种植于人工气候室，生长条件为：在黑暗16℃下生长8小时，在25℃下300 μmol·m-2·s-1光照强度和相对湿度为75光照下生长16小时。人工气候室的肥水管理条件保持一致。 2019年6月~2019年7月 胡萝卜的幼苗的种植与管理。 进一步阅读相关文献，熟悉理论知识和掌握各类分子生物学实验技术。 2019年8月~2019年11月
胡萝卜ABF转录因子基因DcABF1基因的检索。 胡萝卜DcABF1基因的克隆。 胡萝卜DcABF1基因在非生物胁迫下的表达量检测。 胡萝卜NAC转录因子家族基因的检索。 胡萝卜NAC转录因子基因在非生物胁迫下的表达量检测。
2019年12月~2020年1月 分析基因克隆和RT-qPCR的实验结果。 2020年2月~2020年4月 完成实验数据的整理分析，撰写科技论文。
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