1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
草莓属于蔷薇科（rosaceae）多年生草本植物，属于浆果类果树。世界草莓属约有24个种,主要分布在亚洲、欧洲和美洲，由2×，4×，5×，6×，8×等不同倍性构成，其中，森林草莓（f. vesca）、五叶草莓（f. pentaphylla）、黄毛草莓（f. nilgerrensis）、西藏草莓（f. nubicola）、纤细草莓（f. gracilis）、东北草莓（f. mshurica）、绿色草莓（f. viridis）和裂萼草莓（f. daltoniana）、日本草莓、饭沼草莓为二倍体种（雷家军等，2015）。低倍性野生草莓种质中蕴藏着丰富的优良性状基因资源，是栽培草莓品种改良的重要材料。利用野生草莓改良栽培草莓有关报道中，森林草莓（f. vesca）应用较多，其他偏少。秋水仙素诱导染色体加倍是草莓倍性的重要育种途径，通过秋水仙素等手段使其染色体加倍再进行杂交，是进行种质创新及品种改良的较佳途径。
到目前为止,染色体加倍技术已在苹果、梨、桃、葡萄、草莓、柑桔等果树中诱变成功，且有些已经得到广泛利用。dermen和darrow（1938）用秋水仙素诱导加倍得到4x的森林草莓(fragaria vesca)和16x的凤梨草莓(f. ananassa);雷家军等（1999）用秋水仙素处理草莓茎尖,得到了草莓野生种、种间杂种及品种共27个加倍株系和一些混倍体株系；石荫坪等（1993）用不同浓度的秋水仙素处理苹果的杂种胚获得同质四倍体；王长泉等（1997）用秋水仙素处理苹果品种‘嘎拉’和‘千秋’离体营养器官,获得了单细胞或少数细胞起源的不定芽,既保持了原品种的优良性状, 又可获得高频同质四倍体；王娜等（2003）用秋水仙素诱导了二倍体的冬枣和酸枣得到了四倍体植株。不同染色体倍性草莓种间远缘杂交研究早期多采用染色体加倍结合有性杂交的方法以获取杂种后代，且在森林莓(fragaria vesca) 的不同类型种质向栽培草莓转移的过程中获得了成功（evans，1982）。
二倍体野生草莓有许多优良性状，但因其倍性低，与其他栽培草莓染色体倍性差异较大而导致杂交亲和力差而不好利用。黄毛草莓起源于东南亚地区，具有抗旱、耐高温、抗叶部病害等特点，其果实上有产生激素使果实膨大的小种子，果实白色，是培育大果、白果草莓的重要野生种质，该种为典型的自交亲和种，但用于改种杂交常常失败（陈露茜等，2017）；东北草莓属自交不亲和类型（hancock，1999），果实香味浓郁、抗寒性强、具四季结果性，与栽培草莓杂交表现为结籽率是低、杂交不结实、杂种不育等现象，严重制约新品种选育进程。但是，对于二倍体野生草莓的染色体加倍研究却相对于较少，在这一领域还有很大的发展空间，当前未能有有效的方法将二倍体野生草莓的优良性状导入栽培草莓中。我们应该增加对二倍体野生草莓染色体加倍的研究。因此，利用秋水仙素处理野生草莓属的二倍体植株，获得对应的同源四倍体植株，既可以为进一步对它们的利用提供了基础，新倍性的产生也可以产生多种杂交育种途径，得到不同倍性的中间体。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标
我们希望通过东北草莓和黄毛草莓染色体加倍和性状鉴定的观察实验，得到更易于与栽培草莓杂交的多倍体材料，以期更好的利用野生种质资源。
2.研究的内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法与实验方案
1.1 植物材料
引自沈阳农业大学的绿色草莓42株系，所有的材料都是在温室中生长，
1.2 组织培养及染色体加倍
继代培养基(MS 0.4mg·L－16－BA 0.1mg·L－1NAA )、初代培养基、叶片再生及增殖培养基（MS 1.0mg·L-1TDZ 0.1 mg·L-1IBA）、生根培养基(1/2 MS 0.2mg·L－1IBA )、盆栽土配方：（营养土：蛭石：珍珠岩9：3：1）0.15秋水仙素处理草莓离体芽尖48h诱导效果最佳。
1.3 流式细胞仪及染色体计数鉴定
利用流式细胞仪初步检测是否加倍成功，参考Akiyama方法并略有改进，取4～5 叶片组培苗植株嫩叶约0.1g，并在装有1.0 mL核提取缓冲液［15 mmol·L－1 Tris-HCl (pH 值7.5)，80mmol·L－1KCl，20mmol·L－1NaCl，20mmol·L－1EDTANa2，2.0 PVP，体积分数0.1的TritonX－100］的培养皿中切碎，孵育5 min 后，400目尼龙网过滤，得到细胞核悬浮液。吸取细胞核悬浮液300 uL，加入同等体积的碘化丙啶染液( 45 mg·L－1ＲNaseA，10μg·mL－1 PI) ，混合摇匀后置于冰水混合物中避光染色2 h后上机测定样品单个细胞核的DNA含量。以二倍体绿色草莓为对照，每测10个样品即测定1次对照样品。
1.4形态学指标测定
1.5 自交、杂交授粉实验
2.绿色草莓、四倍体绿色草莓DLs1互交；四倍体绿色草莓自交；以红颊草莓为父本，与绿色草莓、四倍体绿色草莓杂交。取雷花期花粉，烘箱中散粉12h，用玻璃棒碾磨花粉继续散粉12h，于第二天早晨授粉。
1.6 花粉管生长动态观察
草莓、四倍体绿色草莓DLs1互交；四倍体绿色草莓自交；以红颊草莓为父本，与绿色草莓、四倍体绿色草莓杂交。参照Hiratsuka等的方法并作了部分修改。授粉后2，6，12，24，48，72，96分别采集４个授粉组合各15朵花，用FAA（5ｍＬ福尔马林、3mL冰醋酸、90mL体积分数70％乙醇）固定。待样品全部取完后，将固定的花柱从基部切下复水，然后将花柱置于2mol/LNaOH溶液中，65℃水浴2h，蒸馏水冲洗3次（约2h），放入预先配制好的水溶性苯胺蓝溶液（1g/L苯胺蓝＋0.1mol/L磷酸钾）中染色约12h。花柱压片参照Knox的方法，在载玻片上滴一滴甘
油，花柱整体压片，在OlympousBHF荧光显微镜下观察花粉萌发及花粉管在花柱内的生长情况并照相（放大倍数为400×）。 1.7 花粉活力测定、花粉形态观察 于盛花期，在小区内随机抽样10株，取第1花序的第2朵正常花花粉，将其均匀散落到含培养基的载玻片上。培养基配方为 0.5琼脂、10 蔗糖、0.01 H3 BO3，25℃下培养16 h，在低倍显微镜下观察，选取含30个以上花粉的视野，统计花粉管长度大于花粉粒直径的花粉数，计算其占总花粉数的百分率。重复3次，取平均值。 2.技术路线 取材→进行组织培养和染色体加倍→染色体计数鉴定和形态学指标测定→自交、杂交授粉实验→花粉管生长动态观察→花粉活力测定及花粉形态观察 3.可行性分析 （1）实验室设备齐全，研究条件良好，具有进行实验观察的各种基本配套仪器与实验药品； （2）在白马教学基地有独立的塑料大棚的方格田，带着做实验的师兄有着丰富的草莓种植技术及丰富法实验室经验； （3）本人查阅了相关的文献资料，并制定了合理的实验方案，且对理论课中对草莓有了一定的了解，具备了实验的理论基础。 |
4. 研究创新点
（1）染色体加倍育种手段分析，获得了四倍体黄毛草莓、东北草莓株系，为进一步利用黄毛，东北草莓提供了材料基础。
（2）鉴定了四倍体部分性状，相对于二倍体，四倍体的优异性状及其利用价值，为进一步利用这些性状提供了基本的数据基础。
（3）四倍的进化机制，二倍体东北草莓与四倍体东方草莓（f. ientalis lozinsk）、六倍体麝香草莓（f. moschata duch.）的亲缘关系最近，东北草莓可能是它们的原始种（雷家军等，2001）。
5. 研究计划与进展
1.研究计划
（1）2018年：引自沈阳农业大学的绿色草莓42株系，所有的材料都是在温室中生长；随后进行组织培养基染色体加倍，之后再进行染色体计数鉴定；移栽后待其开花，进行形态学指标测定（花径，叶宽长等）
（2）2019年5-8月：进行自交杂交授粉实验；之后根据授粉取材进行花粉管生长动态观察，并拍照；对相应的实验数据进行统计及分析
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