1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
蕙兰（cymbidium faberirolfe.）为兰科兰属，是多年生草本植物。原产地为中国，野生蕙兰常生长于海拔1000m-2500m的山区，主要分布在中国大陆的陕西省南部、甘肃省南部、浙江省、安徽省、湖北省、四川省等地，常生长于林下阴湿处。兰科花卉一般分为热带兰和中国兰两大类，蕙兰是国兰的代表之一，花茎直立生长，一茎多花，花型优美，花香清新怡人。蕙兰又名九子兰、九节兰、夏兰，蕙兰根为肉质根，颜色淡黄，有卵形假鳞茎[1]，是中国常见的人工栽培的兰花种类。
随着“国兰热”的蓬勃发展，越来越多人对国兰鉴赏燃起浓厚的兴趣。而兰香则是人们评判兰花品质的一个关键因素。蕙兰（cymbidium faberirolfe.）作为我国历史上栽培历史悠久的、深受人们喜爱的兰花种类之一，同样也具备了香味清幽、沁人心脾的优良特性。为了达到开发利用蕙兰香气的经济价值、改良品种特性、创造新品种等目的，掌握蕙兰香气的成分和散发香气的机理就显得尤为必要。1990年，日本omata[3]等研究发现了蕙兰香气中的33种挥发性成分认为meja和茉莉酮酸甲酯是使中国兰花含特有的清香的主要原因。彭红明[4]在研究中应用了气相色谱-质谱联用（gc/ms）的试验方法对包括蕙兰在内的多种国兰化学成分进行定性和相对定量的分析，发现蕙兰香气的主要成分为：茉莉酸甲酯a、茉莉酸甲酯b、3-氧代-2-(2-戊炔基)-环戊基乙酸甲酯等酯类物质；金合欢醇、2-丙基戊醇等醇类物质；长叶烯、罗勒烯、柠檬烯等萜烯类物质；异佛尔酮、香叶基丙酮等酮类物质；并指出酯类物质是决定国兰与样兰香味差异的一大因素。方永杰[7]等的研究发现，茉莉酸甲酯是蕙兰香气成分中保留时间最长的物质之一，对蕙兰香气有显著的贡献作用。袁媛等[8]对9个品种的蕙兰香气成分进行了分析，鉴定出了144种挥发性成分，茉莉酸甲酯在9个品种的蕙兰中均被检测到，且含量较高。酯类物质通常都具有怡人的香气，meja具有愉快的茉莉花香气，反-3-氧代-2-(顺-2-戊烯基)-环戊乙酸甲酯为meja的同分异构体，伴有香甜且持久的大花茉莉精油花香。
茉莉酸甲酯（meja）是一种茉莉酸类化合物（jas），属于植物生长调节剂，对植物生长起着整体性的调节作用，主要与植物的抗逆性相关[9]。茉莉酸甲酯作为挥发性物质，会对芳香植物的挥发性产生影响，使植物产生某些特异性的挥发物质[10]，如使用茉莉酸甲酯外源喷施茶叶的叶片，可诱导茶叶产生挥发性物质，并影响茶叶挥发性物质的组成与释放量[11]。茉莉酸甲酯茉莉酸类物质的合成途径研究最早起始于1990年，主要针对的植物为番茄(lycopersicon esculentum)和拟南芥(arabidopsis thaliana)。jas的合成,从本质上说是以从细胞膜上释放出的亚麻酸(以及亚油酸)为底物开端的一系列酶反应。茉莉酸类化合物的代谢途径一共有7种。其中产生茉莉酸甲酯的途径是茉莉酸通过茉莉酸甲酯转移酶(jmt)的催化，进而发生甲基化，最终产生茉莉酸甲酯[12]。收集花香中的挥发性物质有多种技术方法，主要有固相微萃取技术（spme）、动态顶空技术(dynamic headspace)，又称吹扫捕集法(purgetrap，pt)、蒸馏萃取法（sed）、吸附丝累积法、超临界流体萃取法(supercritical fluid extraction，sfe) 等。其中，最常用的方法为固相微萃取技术（spme），该技术通常会与气相色谱-质谱联用仪（gc/ms）组合使用，spme技术用于提取植物中的挥发性气体成分，气相色谱-质谱联用仪则用于快速定量分析出样品中的有机物含量。spme技术是利用了“相似相溶”的原理，通过石英纤维表面的液体固定相吸附原材料中的有机物质，从而将有机组分萃取出来，逐步富集，从而为后续的gc/ms分析做准备。气相色谱-质谱仪首先利用进样口的高温将萃取出的待测有机组分解吸下来，接着解析并进样，色谱柱使样品混合物分离之后进入质谱仪，最后呈现出质谱图。存在色谱峰的质谱图若与标准化合物的质谱图高度一致，且能够保留相同的时间，则判定该化合物为相应的标准化合物[13]。spme技术具有高效、准确、快速和灵敏度较高的优点，是一种应用价值很高的化学物质分离萃取技术。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容
1、 探究蕙兰花香成分中茉莉酸甲酯昼夜变化的机制；
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1、茉莉酸甲酯含量的测定
分别摘取开花第五天0时、6时、12时、18时、开花第六天0时、6时、12时、18时以及第七天0时的蕙兰花朵，每组材料各取三份，每份两朵，进行顶空固相微萃取（HS-SPME）。
萃取完成之后，将固相微萃取头从三角瓶中拔出，并插入气相色谱-质谱联用仪中，在250℃下进行解吸5min后开始采集数据。色谱条件：仪器进样量为0.2μL，使用的载气为He（99.99），不分流；进样口温度为250℃，柱温起始为35摄氏度，并保持5min，接着以5℃/min的速度升温至100℃，保持3分钟后以10℃/min的速度升温至170℃保持2min，最后以8℃/min的速度升温至250℃，并保持5min。质谱条件：GC-MS的接口温度为250℃，设定电子源温度为250℃，以EI为电离方式，电子能量70eV，共发射200μA电流。扫描质量范围为45~600amu。每组样品设置3次重复，通过内标法计算含量相对值，最终取平均值。
2、转录组测序及分析
样品送测 随机选取健康无病虫害的蕙兰开花第五天白天12点以及晚上12点花朵，每组3份样，送往北京百迈客生物科技有限公司，由该公司在没有参考基因组的前提下，进行高通量转录组测序。
cDNA文库构建和转录组测序 样品总RNA的提取与质量检测由测序公司完成，在构建样品cDNA文库之前，还需对RNA样品的浓度、纯度和完整度再次进行检测，完成检测后开始cDNA文库的构建以及转录组结果的测序。
序列组装和转录组测序文库质量评估 利用边合成边测序（Sequencing by synthesis，SBS）技术可以产生大量高质量的Reads，使用De Bruijn图和测序得到的Read信息，分别识别各个片段集合中的转录本序列，最终获得蕙兰品种‘大一品’的Transcript和Unigene库。将所得Cleandata的重组序列和Transcript和Unigene库进行对比，得到Mappedreads。从mRNA片段化随机性检验、转录组测序数据饱和度检验和插入片段长度检验三个方面对转录组测序文库进行质量评估。
Unigene功能注释 使用BLAST软件将上述步骤所得的Unigene序列与NR、GO（Gene Ontology）、KEGG（KyotoEncyclopedia of GenesGenomes）等数据库进行比对。预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息。最后将有注释信息的Unigene归类整理。
基因表达水平分析 利用TransDecoder软件，基于氨基酸序列、对数似然函数值（Log-likelihood sce）、开放阅读框（Open reading frame，ORF）长度与Pfam数据库蛋白质结构域序列的比对等信息，识别转录本序列中可靠的Unigene潜在编码区序列（Coding sequence，CDS）。利用Bowtie将Reads与Unigene库进行比对，将比对结果与RSEM相结合，进行表达水平估计。用FPKM值（Fragments per kilobase of transcript per million mappedreads）表示对应Unigene的表达丰度。
3、 蕙兰花器官转录组差异表达基因分析
差异表达基因的筛选 利用公司反馈的蕙兰白天与晚上花器官之间的差异表达基因集，在差异表达分析过程中采用校正后的p值，即FDR（False discoveryrate）作为差异表达基因筛选的关键指标，以降低对大量基因的表达值进行独立的统计假设检验带来的假阳性。本研究在差异表达基因的筛选过程中，将FDR小于0.01且差异表达倍数FC（Fold change）大于等于2作为筛选标准。其中，FC表示两样品（组）间表达水平的比值。
差异表达基因功能注释和富集分析 差异表达基因的注释方法以及所使用的数据库同1.2.2.4。
差异表达基因的验证 采用改良CTAB法（Wanget al., 2011）提取蕙兰开花第五天白天12点以及晚上12点花朵总RNA（各三份），进行差异表达基因的表达水平分析，以验证转录组测序结果和差异表达基因分析的准确性和可靠性。为了检测每组提取的总RNA浓度和纯度是否符合标准，每组要在提取的总RNA中取2μL 进行超微量核酸蛋白检测仪分析，并进行琼脂糖凝胶电泳。而后将符合质量要求的总RNA使用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒对总RNA进行反转录，合成cDNA。
根据差异表达基因分析结果及UnigeneCDS分析，选取差异表达基因进行荧光定量验证。以CfGAPDH（GenBank JX560732）为内参基因，使用Primer Premier 5软件设计荧光定量引物，由南京思普金生物科技有限公司进行合成（表1-1）。
使用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseHPlus)试剂盒进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试验，反应体系及步骤如下：
| 试剂 | 加样量（μL） |
| SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×) | 10 |
| Fward Primer(10 μM) | 0.8 |
| Reverse Primer(10 μM) | 0.8 |
| ROX Reference Dye II (50×) | 0.4 |
| cDNA | 2 |
| dH2O | 6 |
反应主要为三步：预变性：95℃，30s；PCR 反应：95℃，5s；60 ℃，34s，40个循环；MeltCurve阶段：95℃，15s；60℃，1 min。
荧光定量反应在QuantStudio3 Real-Time PCR Systems (Thermo Fisher)上进行。每个基因设置3次生物学重复及3次技术重复，结果通过QuantStudio Design Analysis Software1.3.1及Excel软件进行分析。
技术路线：
1、茉莉酸甲酯含量的测定
2、转录组测序及分析
3、蕙兰花器官转录组差异表达基因分析
可行性分析：
申请人所在实验室拥有足够的蕙兰品种‘大一品’材料，可以用于本试验。试验所需的仪器、环境等条件也十分完备。其中，转录组测序的程序由北京百迈客生物科技有限公司进行，该公司多年与本实验室合作。此外，所在实验室多年从事兰科植物分子生物学研究，具有其他兰科花卉的成熟培养体系。预期能按时完成蕙兰花器官茉莉酸甲酯含量的测定、转录组测序及分析、转录组差异表达基因分析。
4. 研究创新点
本试验选用蕙兰品种‘大一品’作为主要研究对象，以茉莉酸甲酯含量为切入点，用高通量转录组测序技术主要研究蕙兰花香昼夜变化的机制。此前尚未有人使用转录组测序技术研究蕙兰花香昼夜变化的机制。
5. 研究计划与进展
2019年4月上旬：准备蕙兰‘大一品’材料；
2019年4月中旬：预试检测蕙兰‘大一品’花香，调试gc/ms程序；
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