梨多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）调控采后果实软化的分子机制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题的意义 果实采后贮藏过程中常发生果实软化、色泽转变、风味改变等现象，从而使其食用品质和耐贮性下降[1-3]。其中，果实软化主要是由细胞壁的结构降解和成分变化造成的，涉及多种细胞壁降解酶和调控因子[2,5]。果胶是细胞壁中初生壁和胞间层的主要组分，对细胞壁的结构稳定性起着关键性的作用[6]，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）是对果胶物质起裂解作用的基础酶，因而在果实软化过程中具有重要作用[7]。PG基因家族成员已经在多种植物中被鉴定，包括拟南芥、水稻、番茄、苹果和桃等[8-10]。在不同植物中，PG具有广泛且不同的作用，其中，PG在果实软化中的作用已在多种植物中被证实[11]。然而，梨PG基因家族还未见报道，其参与果实软化过程的关键基因也未知晓。本课题的开展能够为阐明梨果实软化机制提供理论基础，并为梨果实采后品质的保持和货架期的延长提供基因资源。二、国内外研究进展1. PG的结构与分类 PG是水解酶的一种，属于糖苷水解酶家族28（glycosyl hydrolase family 28，GH28），并至少含有一个GH28结构域[7,12]。在植物和真菌PG中，通常有4个保守的结构域，分别为SPNTDG（motif I）、GDDC（motif II）、CGPGHGISIGSLG（motif III）和RIK（motif IV）[13]。根据PG对果胶裂解方式的不同，可将其分为3类，分别为内切半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切半乳糖醛酸酶（exo-PG）和鼠李糖半乳糖醛酸酶（rhamno-PG，RG），其中RG还可进一步分为内切型（endo-RG）和外切型（exo-RG）[14,15]，具有果实成熟特异性的一般指endo-PG[1]。2. PG基因家族成员在植物中的鉴定 植物PGs由多基因家族编码[16]，得益于测序技术的发展，目前已经在拟南芥、水稻等模式植物，以及番茄、苹果、桃、甜橙、黄瓜、西瓜等多种园艺作物中鉴定到了PG基因家族成员[8-10,17]，并在此基础上对PG基因家族的组成、分类和进化等方面进行了深入分析[15]。研究表明，双子叶植物的PG基因数量相较单子叶植物而言更多，基因家族组成也不尽相同，这也在一定程度上反应了不同种类植物细胞壁结构和组成的不同[18]。根据PG基因间的关系形成了两种分类系统，Hadfield等人[19]提出的分类系统使用较为广泛，将PG基因分为7个分支，各分支之间可体现物种进化关系[15]。然而，目前尚未有研究对梨中的PG基因家族成员进行鉴定。3. PG在植物中的作用 在植物细胞的分裂、生长等过程中都需要对细胞壁进行调整，而果胶是细胞壁的重要组分，因此参与果胶分解的PG可在植物的多个生长发育过程中发挥作用，如器官脱落、果实成熟和衰老、花发育等[13]。器官脱落常在果实成熟过程中或胁迫条件下发生，相应部位会形成离层，包括PG在内的细胞壁降解酶使离层细胞的胞间层分解，最终导致器官脱落[20]。在‘金冠’苹果中，与其他组织相比，MdPG2在离层中的表达量明显较高[20]。此外，Zhang等人[21]通过干扰大白菜PG基因BcMF6的表达，导致突变体植株中花器官变小，花粉数量下降，且其中半数花粉败育，因而PG也参与了花发育过程的调控。 虽然PG的多基因家族成员在植物发育不同阶段和不同组织中表达，表现出功能多样性，但其主要功能为参与果实成熟，并与果实软化密切相关[1]。PG能够催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，使果胶降解，细胞壁结构解体，从而导致果实软化[22]。目前，PG在果实软化中的重要作用已经在番茄、草莓、苹果、桃、香蕉等研究中得到了证实[11]。在草莓中，质地较软的草莓品种中PG活性较高，同时FaPG1也有较高的表达量[23]。进一步研究显示，干扰降低FaPG1的表达水平，会使草莓的组织更加紧密，软化进程明显减缓[24]。在不同品种苹果贮藏期间，MdPG1的表达量在硬度较高的品种中始终维持在较低水平，而在硬度不断下降的品种中则明显上升[25]。同时，MdPG1表达受到干扰的‘皇家嘎啦’苹果具有更高的硬度，其果皮下方的细胞排列得更加紧密，果实质地改变[26]。 此外，梨中也有少量关于PG与果实软化的研究。在西洋梨中，经过短期或长期低温贮藏转入20℃后熟后，果实均有不同程度的软化，但仅有PcPG1的表达量在两种贮藏方式的后熟期间均保持上升，因此在果实软化中具有一定作用，而PcPG3则对后熟后细腻多汁的质地形成更为重要[27]。在易软化梨品种‘Starkrimson’、‘Bartlett’、‘Abbe Fetel’的研究中， PG1仅在其中软化速度最快的‘Starkrimson’果实中具有较高的表达量，PG2则是影响三个品种果实快速软化的重要因素[28]。此外，PG1和PG2的表达均能够被1-MCP抑制[28]。然而，上述研究并未基于梨中PG基因家族的分析展开，仅通过观察个别基因在不同品种、不同时期和不同处理下的表达量变化情况进行探究，且并未对相应基因的功能进行验证。因此，梨中PG对果实软化的作用还需要更为深入的研究。三、应用前景 梨果中富含抗坏血酸、维生素B和钙、磷、铁等矿物质，且具有清心润肺、止咳平喘、醒酒解毒等功效，深受人们喜爱[29]。我国是世界梨生产大国，面积和产量均占世界梨栽培面积和总产量的80以上，消费者对于梨有着较大的需求[30]。随着生活水平的提高，人们对于水果品质的要求也逐步提升，这也对果实采后品质的保持提出了更高的要求，而果实采后的软化对其品质具有较大的影响，并会导致货架期的缩短。本课题能够为阐明梨果实软化机制提供理论基础，并为梨果采后品质的保持和货架期的延长提供基因资源，未来还可结合育种技术开展应用，以提升梨果采后品质。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标

围绕与果实软化密切相关的pg开展研究。通过生物信息学手段鉴定梨pg基因家族成员。随后选取成熟期丰水梨开展贮藏实验，测定其贮藏期间5个不同时期的硬度、pg基因表达情况和pg活性，并进行相关性分析，筛选获得pg基因家族中参与调控果实软化的关键基因并验证。本课题的开展将为阐明梨果实软化机制提供理论基础，同时为保持梨果实采后品质和延长货架期提供基因资源。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法

（1）梨pg基因家族成员的鉴定

利用已知的拟南芥pg基因在梨基因组中鉴定梨pg基因家族成员，并对梨pg基因家族进行初步的生物信息学分析。利用相关软件和在线工具，构建pg基因家族成员进化树，并开展蛋白理化性质分析、亚细胞定位预测等，了解pg基因家族的相关信息，为后续研究打下基础。

4. 研究创新点

（1）思路创新：目前，pg在果实软化中的作用已经在多种园艺作物中得到了证实，但在梨中仅有少量对个别pg基因的相关研究，仅依据个别pg基因在不同时期、不同品种和不同处理下的表达量变化情况进行探究，并未对相应基因进行功能验证，也并未基于pg基因家族开展研究。本课题基于pg基因家族开展，并筛选其参与果实软化的关键基因，具有一定创新性。

（2）内容创新：本课题围绕梨中pg基因家族成员的鉴定及其在果实软化中关键基因的筛选和验证展开，目前尚未有相关研究。本课题的开展能够为阐明梨果实软化机制打下理论基础，并为梨果实采后品质保持及货架期的延长提供基因资源。

5. 研究计划与进展

一、研究计划

2018年8月前，查阅文献资料，了解相关基因家族信息，参与制定实验方案。

2018年8月-9月，收获成熟期的丰水梨果实，进行采后贮藏实验，定时取样冻存待用并开展各项指标的测定。