菊花乙烯信号转录因子CmEIL2的克隆和表达分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

菊花（chrysanthemum morifolium）为菊科菊属多年生宿根草本，是中国十大传统名花和世界四大切花之一，在花卉生产中占有重要的地位。目前商品菊花主要依靠设施栽培，通过光周期调控、栽培调控等方法来实现周年生产供应，能耗成本高昂。为解决这个难题，前人围绕菊花花期的化学调控开展了大量的研究。刘海英等人发现，在光周期诱导期利用50 mg/l乙烯利（etp）水溶液处理菊花‘姹紫嫣红’，其初花时间比对照推迟了19 d，但在绿蕾期喷施相同浓度的etp却提前了菊花的花期^[1]。有研究也表明，喷施一定次数的乙烯利可以推迟国庆小菊‘金陵红玫’、‘金陵皇冠的花期^[2]。利用适宜浓度的外源etp处理菊花可以提前或推迟花期，这说明乙烯可能参与调控菊花花期。

在遗传和分子研究的基础上，目前已明确乙烯信号是通过一条线性的乙烯信号转导途径将信号传递至胞内。在没有乙烯存在下，最上游的乙烯受体蛋白与其下游的ctr1蛋白激酶结合组成受体-ctr1复合体，并定位于内质网膜上，是下游靶基因的负调控因子^[3]。当乙烯的存在时，乙烯与定位于内质网膜上的乙烯受体蛋白结合，解除受体-ctr1复合体对下游基因的负调控作用，从而激活ctr1的下游组件ein2等正调控因子^[4]。接着，ein2的羧基端被切割形成ein2 cend，同时被运送至细胞核内。研究发现ein2 cend可能抑制2个f-box蛋白ebf1和ebf2介导的泛素化降解途径，并使其下游的核心转录因子ein3和ein3-like(eil)激活^[5]。ein3/eil蛋白通过其启动子区中的初级乙烯反应元件(pere)调控erf1等基因表达 ^[6]，引起一系列级联反应，诱导与乙烯相关的基因转录并翻译成蛋白质，从而产生乙烯反应。

eils作为高等植物乙烯信号转导路径的核心转录因子，广泛存在高等植物中，单子叶植物、双子叶植物、苔藓植物和蕨类植物中都有eils基因的存在^[7]。同一植物中可能存在多个结构和功能类似的eils转录因子，且不同植物含有的eils数量存在差异。如在拟南芥中存在5个ateils^[6]；在苹果中存在9个mdeils^[8]，在番茄中存在4个leeils^[9]；而牡丹中则有3个pseils^[10]。eil蛋白存在几个明显的转录因子的结构特征，且氨基端比其羧基端更保守。eil蛋白的n端氨基酸顺序具有60-89%的同源性，存在富含酸性氨基酸的结构域、脯氨酸富集区、卷曲结构和几个高度碱性区域^[11]。在Ｃ端附近含有多聚的天冬酰胺或谷氨酰胺，但其保守性较低，如在烟草nt eils中，eil蛋白c端的天冬酰胺富集区和谷氨酰胺富集区均表现为缺失^[12]。

2. 研究的基本内容和问题

（1）从野生型菊花‘神马’中克隆获得cmeil2基因；

（2）通过生物信息学分析鉴定其为菊花乙烯信号转导的核心转录因子成员；

（3）荧光定量分析该基因在菊花不同生长时期的表达差异。

3. 研究的方法与方案

（1）根据实验室已有的菊花‘神马’转录组数据进行基因克隆，连接克隆载体pmd19-t并转化大肠杆菌dh5α，菌液检测后挑选含有目的片段的单克隆送往生物公司测序，最终获得目的基因orf序列。

（2）利用多种生物信息学软件分析cmeil2的基因结构、系统进化、序列相似性及结构域分布情况，并从理化性质、亚细胞定位、三级结构等几个方面对该基因进行预测和分析。

（3）利用qrt-pcr技术分析cmeil2基因在菊花不同生长时期的组织特异性表达分析。

4. 研究创新点

EILs基因在拟南芥、大豆、水稻等模式植物中有很广泛的研究，但是在菊花中的研究尚未见报。本研究首次从菊花‘神马’中克隆出CmEIL2基因，并对其进行不同生长时期的组织定量分析。

5. 研究计划与进展

（1）2019年07月至2019年09月，完成cmeil2基因的克隆、基因序列分析以及系统进化树构建等生物信息学分析；

（2）2019年10月至2020年1月，扦插一批野生型‘神马’于ld条件下培养，待其生长20片叶左右取根、茎、叶和茎尖的新鲜样品，并在盛花期时去湖熟基地取菊花‘神马’的根、茎、叶、萼片、管状花、舌状花，置于液氮中速冻，提取总rna用于组织特异性分析；

（3）2020年2月至2020年4月，分析数据，得出结论，撰写毕业论文。