1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一．立项依据
1.项目的研究意义：
2. 研究的基本内容和问题
二.研究方案
1.项目的研究目标、内容和拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
2.1研究方法
采用农杆菌介导法将白鹤芋SkMYB27基因转入矮牵牛，采用qRT-PCR分析SkMYB27基因在矮牵牛中是否能正常的转录，并通过对移栽后野生型和转基因矮牵牛的性状进行比较，判断转基因植株的叶片表观是否发生变化。通过qRT-PCR分析矮牵牛叶片中与花青素合成途径基因的相对表达量，初步分析白鹤芋SkMYB27基因是否可能参与调控矮牵牛色素的合成和积累。
2.2技术路线
| 矮牵牛遗传转化体系的建立 |
| |
| |
| 转基因矮牵牛株系叶片半定量PCR分析 |
| 转基因矮牵牛光合色素含量测定 |
| |
| 矮牵牛转基因植株的PCR检测 |
| |
| 转基因矮牵牛花青素合成相关基因半定量及荧光定量分析 |
2.3实验方案
1.2.1.1植物材料的准备
在遗传转化前20 d对矮牵牛无菌苗进行转接，在生长培养基上进行续代培养，配方为：MS 30 g/L蔗糖 5.6 g/L琼脂，pH 5.7。取组培苗顶端生长健壮、大小一致的叶片作为遗传转化的材料，潮霉素（Hyg）的筛选浓度为15 mg/L。
1.2.1.2农杆菌侵染液的制备
挑取携带SkMYB27的单菌落，接种在含有50 ug/ml Kan和50 ug/ml Rif 50 ml YEB液体培养基中，于28℃，200 rpm黑暗条件下，过夜培养14 h,直至农杆菌菌液OD600为1.0-1.5；取上述农杆菌菌液40 ml分装于10 ml的无菌离心管中，4000 rpm，室温离心15 min，去上清；用MS液体培养基重悬将菌体沉淀，震荡至菌块全部溶解，4000 rpm，室温离心15 min，去上清；将菌体沉淀于MS培养基中重悬，震荡至菌块全部溶解，使菌液OD600在0.6-0.8之间，并加入千分之一体积的乙酰丁香酮（AS）（100 umol/L）。
1.2.1.3叶盘法转化矮牵牛
在超净工作台中，取组培瓶顶端生长健壮的矮牵牛幼嫩叶片，用无菌手术刀去掉中脉切成0.5 cmí0.5 cm大小的方块，将叶片背面朝下均匀的放在预培养基（MS 30g/L蔗糖 5.6琼脂 2.0mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA，pH 5.6）上，25℃避光培养3-5 d；选择灭菌好的100 ml三角瓶，将制备好的农杆菌菌液倒入其中，将预培养结束后的矮牵牛叶盘放在盛有菌液的三角瓶中，轻轻摇晃三角瓶侵染约3min，随后将叶片取出，在滤纸上将菌液晾干。接着矮牵牛叶盘置于共培养培养基（MS 30 mg/L蔗糖 5.6 g/L琼脂 0.1 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA，pH 5.6）上，25℃避光暗培养5-7d；经过暗培养后，将矮牵牛叶盘转接到含有抗生素的抑菌培养基（MS 30mg/L蔗糖 5.6 g/L琼脂 0.1 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA 30 mg/L蔗糖 100 mg/L特美汀，pH 5.6）中上进行培养5-7 d；经过抑菌培养后，将叶盘转接到含有抗生素和Hyg的筛选培养基（MS 30 mg/L蔗糖 5.6 g/L琼脂 0.1 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA 30 mg/L蔗糖 100 mg/L特美汀 15 mg/L Hyg，pH 5.6）上进行筛选培养；经筛选培养，待抗性芽在培养基上生长分化至2 cm时，停止筛选，然后将抗性芽切下转移至矮牵牛生根培养基（1/2MS 30 g/L蔗糖 5.6 g/L琼脂, pH 5.6）中促进生根培养30 d；矮牵牛正常生长且长出根系后进行移栽，栽培基质配方为（蛭石：泥炭：珍珠岩 4：4：2），打开组培瓶，加少量无菌水刚好淹没培养基，在光照培养箱中炼苗3-5 d。小心清洗根部琼脂移栽至营养土中，置于光照培养箱中继续培养。光周期为12/12 h，生长温度为白天25℃夜间22℃。
1.2.2.1改良CTAB法提取转化矮牵牛的DNA
通过改良CTAB法分别提取野生型和转基因矮牵牛的叶片RNA，反转录成cDNA，每份材料分别提取3份。
1.2.2.2转基因矮牵牛的PCR检测
以无菌水（H2O）作为CK，野生型矮牵牛（WT）、空载体质粒为阴性对照，含目的基因的重组质粒（P）为阳性对照，用基因克隆引物进行PCR验证。反应体系和条件如第一章1.2.4，取6 ul的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像分析系统中拍照保存及分析。
利用Primer Premier 5.0软件进行白鹤芋SkMYB27基因荧光定量特异性引物设计，由南京思普金生物工程有限公司进行引物合成。挑选3个生长健壮、大小一致矮牵牛转基因株系，选取矮牵牛从顶端开始向下的第5-6片叶片，保存-80℃冰箱备用。改良CTAB裂解法提取总RNA，取1.5 ul RNA样品、1.5 ul 10íLoading Buffer和1.5 ul 10í稀释Gelred荧光染料混合均匀，进行琼脂糖凝胶电泳检测，120 V, 15 min；通过凝胶成像系统进行观察并拍照，检测RNA质量；RNA总浓度通过超微量核酸蛋白检测仪NanoDrop2000TMspectrophoto-meter (Thermo Scientific，USA)进行检测，记录提取的RNA总浓度。
运用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect real time)试剂盒（TaKaRa公司）对矮牵牛叶片的总RNA进行反转录，合成cDNA。根据各样品的RNA浓度，调整加样量，使20.0 ul体系中共加入1.0 ug的总RNA。反转录具体体系及步骤如下：
①去除基因组DNA反应：
| 试剂 | 加样量(uL) |
| 5ígDNA Eraser Buffer | 2.0 |
| gDNA Eraser | 1.0 |
| Total RNA | up to 1.0 ug |
| RNase Free ddH2O | up to 10.0 |
反应条件为42℃，2 min;
②反转录反应：
| 试剂 | 加样量（uL） |
| 步骤（1）反应液 | 10.0 |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0 |
| RTPrimer Mix | 1.0 |
| 5íPrimeScript Buffer 2(f Real Time) | 4.0 |
| RNase Free ddH2O | 4.0 |
反应条件为37℃15 min、85℃5 s。完成反转录后向获得的cDNA中再加入80 ul RNase Free ddH2O进行稀释，充分混匀后保存于-20℃，以备qRT-PCR试验。
选择矮牵牛PhF3H、PhF3H、PhANS基因的荧光定量引物，选取矮牵牛PhGADPH为内参基因，荧光定量引物由南京思普金生物工程有限公司合成。引物序列见附录1。PCR反应条件是94℃2 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，循环数为27次，72℃10 min。反应结束后，取2.5 ul的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；根据内参基因的条带亮度，调整PCR产物染料比例，使得在不同转基因株系中内参基因的亮度一致，记下PCR产物的加样量。以PhF3H、PhF3H、PhANS基因引物作上下游，非转基因矮牵牛材料作为阴性对照，进行PCR扩增，按时内参基因反应条件及相应PCR产物比例进行电泳检测观察，并拍照记录。
矮牵牛光合色素测定参照徐佼俊的方法[7]，取生长状态相同的野生型和不同转基因株系的矮牵牛叶片0.15 g，于含10 ml 95乙醇的离心管中充分剪碎，避光浸泡大约24 h，至叶片完全变成无色透明状。将浸泡液在紫外分光光度计UV-1800(上海美谱达仪器有限公司)下进行测定，分别在记录在470 nm、649 nm、665 nm的波长下的吸光值。矮牵牛叶片中叶绿素总浓度和类胡萝卜素浓度（mg/L）的计算公式：Ca13.95A665-6.88A649、Cb24.96A649-7.32A665、CtCa Cb、Cx.c(1000A470-2.05Ca-114.8Ca)/245（Ca：叶绿素a的浓度；Cb：叶绿素b的浓度；Ct：叶绿素总浓度；Ct.c类胡萝卜素总浓度），叶片中所含色素含量：色素含量（mg/L）（提取液体积í色素浓度）/样品鲜重。
选取矮牵牛PhGADPH为内参基因。荧光定量引物。引物序列为
| SkMYB27-F1 | 5-CCTTGCCTGATCTAAACCTGGACATC-3 |
| SkMYB27- R1 | 5-CGTAGCACTCGCCTTCGTCTCTA-3 |
| PhANS-F2 | 5-TCTTCCATTGTGCTTTCCCTG-3 |
| PhANS-R2 | 5-GTTGCTGGAGTGTAGTCAGTAG-3 |
| PhF3H-F1 | 5-CCAACAAGGGCAAGAGACT-3 |
| PhF3H-R1 | 5-GCTATTTGAGTTCACCACTGC-3 |
| PhGAPDH-F | 5-CAAGGCTGGAATTGCTTTGAG-3 |
| PhGAPDH-R | 5-CACCACTTTACTCCACTGATGCA-3 |
通过改良CTAB法分别提取野生型和转基因矮牵牛叶片的RNA并反转录成cDNA，每种材料各取3份,进行荧光定量分析。根据TaKaRa公司的TB Green PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus)荧光定量试剂盒进行荧光定量操作：反应体系如下：
| 试剂 | 加样量（uL） |
| TB GreenPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) | 10.0 |
| Fward/Reverse primer | 各0.8 |
| ROX Reference DyeⅡ(50) | 0.4 |
| cDNA | 1.5 |
| ddH2O | 6.5 |
反应条件：预变性：95℃30 s；PCR定量分析：95℃5 s、60℃30 s、40个循环；融解曲线：95℃5 s、60℃1 min、95℃15 s。
qRT-PCR反应在QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)仪器上进行。每个反应设置3次技术重复和3次生物学重复，运用IBM SPSS Statistics和Excel等软件进行数据统计分析。
2.4可行性分析
实验室具有较多的矮牵牛材料，并开展花烛研究多年。同时,本实验室拥有该研究中所需的各种仪器、药品等，采用的方法均为本实验室已有成熟方法，包括无菌操作、接种继代,DNA提取和PCR扩增等。
4. 研究创新点
3.本项目的创新之处
关于关于白鹤芋skmyb27基因在花青素合成途径的作用的研究极少，通过农杆菌介导法将skmyb27基因转入矮牵牛，然后比较转基因矮牵牛和非转基因矮牵牛的表型，研究外源基因对矮牵牛花色形成过程中的作用，进而明确白鹤芋skmyb27基因在花青素合成途径的作用，可以为白鹤芋不同花色新品种的选育、丰富白鹤芋种质资源提供工作基础。
5. 研究计划与进展
4.项目研究计划及预期进展
2018年10月-11月：矮牵牛植株材料准备；
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
