1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
芹菜，伞形科芹属一二年生草本植物，营养丰富且具有一定的药用价值，是国内外主要的栽培作物之一。非生物胁迫是影响芹菜生长发育、产量和品质的重要因子。高温、低温、干旱和盐胁迫等会对芹菜造成细胞膜结构等方面的损伤，对芹菜的产量和品质造成不利影响[1]。
β-胡萝卜素羟化酶（β-carotene hydroxylase, bch）在类胡萝卜素的合成过程中具有非常重要的作用，可催化β-胡萝卜素使中间产物β-隐黄素（β-cryptoxanthin）合成玉米黄素（zeaxanthin），使植物细胞在不良环境下产生的损害自身活性的各种过程得以减缓，增强有关的修复能力[2,3]。许多研究发现，植物bch基因在高温、干旱、盐胁迫、强光照等胁迫下表达情况发生显著变化。davison等在拟南芥中过表达atbch基因，其抵抗强光、紫外线和高温等非生物胁迫的能力明显提高[4]。在过表达crtrb1基因的玉米中, 研究发现β-胡萝卜素增加量高达12.6倍[5]。转chyb基因的烟草植株对盐胁迫的耐受性增强[6]。强光胁迫下植物过量吸收光能时，玉米黄素能够促使植物以热能等形式释放多余的能量, 抑制单线态活化氧的生成，防止光氧化对植物细胞的破坏, 起到光保护的作用[7]。
热激转录因子（heat stress transcription fact, hsf）是一种能特异性识别和结合hsps启动子区的热激元件（heat shock element, hse）的反式作用因子，通过调控热激蛋白（heat shock protein, hsp）基因的表达[8,9]，在植物的信号转导和耐热过程中发挥重要作用[10]。hsfs的五个典型结构特征包括n端保守的dna结合结构域（dna-binding domain, dbd）、寡聚化结构域（oligomerization domain, od或hr-a/b）、核定位信号（nuclear localization signal, nls）、核输出信号（nuclear expt signal, nes）和c端转录激活结构域（c-terminal domain, ctd）[11]。根据插入hr-a/b区的氨基酸残基数目，hsf转录因子家族成员可分为a、b、c三类[12]。hsfa通常在hr-a和hr-b之间插入21个氨基酸残基[13,14]。hsfb在hr-a/b区无氨基酸残基插入。大多数hsfc的hr-a和hr-b之间插入的氨基酸残基数目只有7个[15,16]。植物体内hsfa所占的组分大于hsfb，hsfb所占的组分大于hsfc。三类hsfs在植物体内所占组分呈下降趋势的现象，在一定程度上反映a、b、c类hsfs在植物抗高温胁迫过程中的不同作用。hsfa广泛参与植物对热激、氧化、盐胁迫等响应过程，尤其在植物耐热性方面起着重要调控作用。hsfa蛋白c端的转录激活域使hsfa蛋白具有明显的转录激活活性。有关番茄和大豆的研究表明，hsfa1基因在调节热激反应（heat shock response, hsr）中起着重要作用，hsr是植物感知和响应热激信号、调节细胞代谢所必需的。charng等研究证明，前期37 °c热激预处理的拟南芥hsfa2突变体植株在室温条件下长时间恢复时，面临高温度的热胁迫处理会较为敏感[17]。hsfb可通过其c端保守的b3抑制结构域（b3 repression domain, brd）抑制正常生长条件下耐热基因的活性，从而降低基因的表达[18]。zhang等发现，拟南芥植株中过表达tahsf3基因，相比对照其hsp70的表达水平较高，转基因植株的耐热性和耐冷性也显著增强[19]。
2. 研究的基本内容和问题
1)研究目标
以芹菜‘六合黄心芹’为试验材料，从中克隆获得编码芹菜β-胡萝卜素羟化酶的基因agbch1。结合芹菜转录组数据库，筛选获得芹菜hsf转录因子家族成员，结合拟南芥中hsf家族分组情况对芹菜hsf tf进行分组，并进行相关的生物信息学分析。通过荧光定量pcr分析，检测芹菜bch1和hsfs基因在高温、低温、干旱、盐四种非生物胁迫下的表达情况。
2)研究内容
3. 研究的方法与方案
1)研究方法
（1）根据老师提供的相关文献，熟悉bch基因及hsf转录因子的相关知识。在老师的指导下，掌握相关分子生物学软件的使用、相关仪器的使用及相关试验操作和试验数据的采集与分析；
（2）使用rna simple total rna kit试剂盒（tiangen, 北京），分别提取经过不同处理的芹菜叶片总rna。通过prime script rt reagent kit （takara, 大连）将提取的总rna反转录得到cdna；
4. 研究创新点
（1）hsf转录因子家族的研究主要集中在拟南芥、水稻和番茄等模式植物上，在伞形科蔬菜作物芹菜中还没有研究。aghsfs对非生物胁迫响应的相关研究未见报道。本课题通过对芹菜类hsfs基因对胁迫环境响应情况的研究，可以为抗性基因的筛选及芹菜耐高温品种的选育提供理论依据；
（2）目前类胡萝卜素相关代谢途径已有报道，但有关芹菜类胡萝卜素相关基因的研究报道较少。β-胡萝卜素羟化酶基因是在类胡萝卜素的合成过程中具有非常重要作用基因，并且在植物对不良环境产生抗性的过程中也具有比较重要的作用。对芹菜bch在逆境下的表达进行研究，进一步丰富了类胡萝卜素相关基因在逆境下响应的研究；
（3）本研究以芹菜为研究对象，从逆境种类和处理时间几个不同的角度构建起对芹菜bch和hsfs表达量预测的多维视角，更全面地研究芹菜bch和hsfs对不同逆境的响应情况。
5. 研究计划与进展
Ⅰ芹菜β-胡萝卜素羟化酶基因agbch1的克隆及其对非生物胁迫的响应
2018年4月～2018年6月 芹菜的种植和试验知识储备；
将‘六合黄心芹’种子播种于含有有机土：蛭石：珍珠岩（221, v/v）的塑料盆中置于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点试验室人工气候室生长。人工气候室条件为：昼夜条件16 h/8 h和25 ℃/18 ℃，300 μmol·m-2·s-1光照强度。人工气候室的肥水管理条件保持一致。
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