葡萄Homebox基因家族的鉴定及其在芽休眠中的表达分析开题报告

课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）

一．研究意义

本课题旨在研究葡萄Homeobox（HB）基因家族的鉴定及其在芽休眠中的表达分析。葡萄和其他许多物种一样，在其漫长的进化过程中，为了应对不利的环境条件，会进化出许多生物特性。芽休眠是多年生木本植物对抗逆境胁迫的代表性生理现象之一，是果树生存、产量和质量的前提和保证，是植物种群在不利环境条件下生存和繁衍的基础。有研究表明，HB家族基因中有多个成员在植物休眠中发挥调控作用，但目前对HB基因如何调控葡萄芽的休眠还没有系统的研究，本课题从HB基因与芽休眠关系入手，通过系统鉴定葡萄HB基因家族成员、序列与结构特征分析以及芽休眠表达谱分析，进而为深入分析HB基因家族成员在葡萄芽休眠中的生物学功能提供靶标与奠定基础。

二．国内外研究进展

1.芽休眠的定义、作用及其影响因素

1.1芽休眠的定义

芽休眠当前较为广泛接受的定义是由LANG等提出的“包括分生组织在内的任何结构可见生长的暂时停止”^[1]，他根据休眠的诱导因素将其分为３类：

1）相对休眠，指由植物细胞内部特殊的化学信号诱导产生的生长停滞现象，该化学信号不是由休眠组织内部信号独自诱导产生的，诱导其产生的生理因素包括顶端优势、日长差异和光周期等^[1]；

2）生理休眠，指植物内部原发性反应所引起的生长停滞现象，这种原发性反应是由休眠组织内部信号独自诱导引发的^[1]；

3）生态休眠，由不良环境因子所引起的休眠，如水分缺乏、营养亏缺、极端环境温度等，一旦环境条件适宜，植物便可重新恢复生长^[1]。

另外还有由ROHDE等提出的芽休眠定义“在适宜条件下，具有生长能力的细胞、器官或分生组织不能起始生长的现象”^[2]。多数木本植物的芽休眠通常是从一年春萌开始一直持续到翌年春萌周而复始的过程，其芽休眠是其在长期的自然进化过程中形成的对环境和气候的生物学适应，是一种相对现象，并非绝对停止一切生命活动^[3]。

1.2芽休眠的作用

多年生植物在连年生长过程中，会受到因季节性气候变化和外界环境因子导致的不良环境条件影响，如冬天低温霜冻、夏天高温灼伤、季节性干旱或洪水等，这些不良条件严重影响植物的正常发育和生长。为适应不同的气候条件，植物在长期演化过程中，能够通过一系列物质、能量代谢调节自身生理活动而进入休眠状态，以应对或避开短期或长期的不利环境条件^[3]。和其他多年生植物一样，葡萄芽休眠是适应环境变化的生存策略，为了抵御低温、干旱等逆境胁迫形成的特殊生理机制。在逆境时进入休眠维持最低水平的生理状态，确保植物体的安全，等到环境适宜时可以恢复生长是茎端分生组织随环境变化在活跃生长和休眠状态之间转变的动态过程。芽休眠对热带、亚热带暖冬地区和设施栽培葡萄生产尤为重要^[3][4]。

1.3芽休眠的影响因素

短日照光周期（SD）和低温是诱导是引起葡萄芽进入休眠的两个主要外部环境因子，此外葡萄芽休眠还受水分代谢、钙离子信号转导、激素、糖，多胺、酶以及基因等内部因子的调控。

1.3.外部因素

短日照光周期：光照通常被认为是调控多年生木本植物休眠诱导的基本信号。葡萄冬芽进入生理休眠由SD驱动。对于葡萄冬芽而言，即使是在适宜生长的温度下，通过人为改变光周期，对冬芽进行短日照处理，也能够诱使葡萄冬芽进入休眠状态。葡萄叶片和冬芽可同时接受光信号，提前落叶延迟生理休眠形成^[9]。对于大多数多年生植物而言，当满足临界日长和足够的短日照天数时，通常短日照可引起停止生长，而长日照促进生长。在温带生态系统中，光周期是季节性气候变化最可靠的指示者^[3]。

温度：低温诱导生理休眠并增加休眠深度，低温对于诱导芽休眠有着较为明显的效果。低温使参与碳水化合物和能量代谢的基因受抑，参与信号和细胞生长的基因被激活。低温降低芽体内组织细胞生理活动水平，使芽体进入深度休眠^[3]。低温可促进生理休眠的起始，然而延长低温时间，则会致使生理休眠的解除^[4]。

1.3.2内部因素

水分代谢：研究表明桃树芽和葡萄冬芽在休眠过程中，束缚水和自由水含量随着休眠程度的加深分别表现出增加和降低的变化趋势，而二者的含量随着休眠的解除也会呈现相反的变化趋势，细胞内和细胞间水的流动性增加。在休眠诱导期，芽内的总含水量下降，自由水含量不断下降，束缚水含量随之上升^[3][4]。

钙离子信号转导：钙离子在芽内起到了传递短日照的信号以及低温的信号的作用，从而诱导植物进入休眠状态，在低温状态下，细胞内的钙离子逐渐开始从细胞壁、细胞间隙与液泡内逐渐流入细胞质与细胞核内，从而诱导芽休眠，发展抗冻性。钙是植物信号转导级联反应系统中最主要的第二信使，参与调控包括环境刺激响应、花芽分化等多种生长发育过程，对调控植物芽休眠具有重要作用^[6]。

激素：不同激素含量的变化以及激素之间相互的作用对芽休眠进行调节^[3]。激素变化的规律一般为：诱导休眠阶段，ABA随休眠的加深含量逐渐升高，而GA，CTK与IAA则是随着休眠的加深含量逐渐降低。马海燕对星比诺、赤霞珠葡萄研究表明，(IAA GA₃) /ABA的值在芽休眠前期相对较高，并随休眠加深而逐渐下降，休眠最深时达到最低，此后，随休眠解除该比值逐渐上升，萌芽时达到最大值^[[4][5]。

糖：糖作为一种常见的能源物质和植物体重要的组成成分，既能为生命活动提供能量，又能够维持植物体细胞质的稳定，并可作为一种信号物质参与生物体的发育活动^[8]有研究表明，葡萄自然休眠前期淀粉含量迅速下降，随后保持稳定^[7]。

多胺：多胺(polyamine，PA)是大量存在于植物体内、具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱，包括腐胺、尸胺、亚精胺、精胺及其他胺类等^[1]。研究表明多胺在植物体内含量的变化和芽休眠的开始与破除有着密切地相关性^[3]。

酶：低温作为一种非常重要的环境信号参与多年生植物芽休眠的调控^[3]。对桃^[8]和葡萄^[1]等植物芽休眠的研究表明，芽休眠诱导及解除过程中，CAT活性开始下降，深度休眠时降到最低水平，后逐渐上升；POD活性变化与CAT活性相反；SOD活性初期上升并保持较高水平，随休眠的加深而逐渐下降 ^[5]。

诱导芽休眠相关基因：NCED家族基因在芽的休眠诱导以及深度休眠阶段起到重要的调控作用。在蓝莓自然休眠进程中，前期的低温积累抑制GA20ox基因表达、诱导GA2ox基因和DELLA基因表达，内源GA活性降低，使芽的活跃生长停止，芽休眠建立^[9]。

维持芽休眠相关基因：在蓝莓自然休眠进程中，前期的低温积累诱导CBF及DAM基因表达，维持芽休眠^[9]。

芽休眠解除相关基因：PpCYP707A2和PpCYP707A3在芽休眠解除阶段起到重要的调控作用。长期的低温积累诱导FT基因、KO基因的上调表达，抑制GA2ox, DAM、脱水素基因的表达使休眠解除^[10]。在休眠解除过程中MAPK相关基因很可能参与ABA,H₂0₂的信号转导，从而解除休眠^[15]。PpcDAM在樱桃花芽中被低温诱导表达，对花芽的萌发具有抑制作用^[11]。

休眠期物质调控相关基因：PpAMY，PpBAM1，PpBAM2和PpPHS可能参与了‘翠冠’梨花芽休眠期碳水化合物代谢的调控^[12]。

2. HB基因家族的相关信息

Homeobox (HB) 是一类非常保守的基因，它不但在动物、菌物及植物中广泛存在，而且在每个物种的基因组中都有多个结构相似、功能相近或相关的成员，所以被称为HB基因家族^[1][13]。HB基因家族与生物的发育控制过程有关，了解HB基因的功能将有助于研究发育控制的机理。HB基因首先在果蝇中发现，现已在动物中克隆了350余个。1991年，植物中第一个HB基因在玉米中克隆，随后，在玉米、拟南芥、水稻以及大麦中都克隆了一些HB基因，并正在开展功能研究。但是与动物研究相比，植物尤其重要农作物中的HB基因研究还刚刚起步^[14]。

HB基因家族成员间保守性主要在于由它们编码的蛋白质中含有HB结构域，在HB基因中编码HB结构域的DNA序列是很保守的，它们以家族的形式广泛地分布在基因组中^[13]。HB基因家族成员在植物的胚胎发生、aba反应和非生物胁迫等方面起着多种重要的作用^[1]。

2.1 HB基因的分类

根据植物HB蛋白中HD基序的位置和序列差异，及其两侧序列的同源性和其他保守结构域的不同^[14]，植物HB基因家族可分为以下几类。

与玉米的Kn1基因具有较高的相似性的KNOX型；具有同源异型结构域（HD）的同源域-亮氨酸拉链（HD-Zip）型，其蛋白在植物发育过程中的作用非常广泛，如维管发育、器官形成、分生组织的维持、逆境应答等^[20]；编码的蛋白具有同源域蛋白指的同源域蛋白指（HD-Finger）型，其含有高度保守的排列规则的半膀氨酸残基；在N段有一个由半膀氨酸或组氨酸组成的保守锌指结构域的同源域指状（ZF-HD）型；编码的氨基酸序列接近HD-Zip，但不含亮氨酸拉链，与表皮细胞的差别有关的HD-GL2型；新发现的植物特异的WOX基因对应的WOX型^[19][21][22]；主要为胚珠、体壁等发育所必须的HD-BEL型^[3]。

2.2 HB基因的结构

从结构上看，这类基因最重要的特征就是都有一个180bp的保守的Homeobox，正是它编码的60个氨基酸的同源结构域蛋白具有转录因子的特征，这是与特定序列的DNA结合的结构域，称之为同源结构域(Homeodomain)^[18]。除此之外，在同源结构域的上游会有一系列的保守的Glu、Leu和Lys残基，它们被称为ELK结构域，是许多同源结构域蛋白共同的结构基序，可以作为核内定位信号(NLS, Nuclear Localization Signal)^[24]。另外还有植物同源结构域蛋白指(PHD finger, Plant Homeodomain Finger)，其包含高度保守的规则排列的半胱氨酸残基，具有与铁氧化还原蛋白(ferredoxin)形成Fe-S复合物的结构域的特征，该复合物与电子转运过程有关，可能是对氧化还原作用敏感的环境信号的感应器^[24]。此外还有在细胞膜上的定位至关重要的类骨胶原结构(collagen-like)，其与蛋白质-蛋白质之间的互作有关，许多类骨胶原重复单位中都含有肉豆蔻化(Myristylation)的识别位点^[14]。在一些HB基因编码的蛋白质中，还具有非常保守的磷酸化作用位点，称之为磷酸化基元以及能与一对DNA结合位点分别结合亮氨酸拉链(Leucine-zipper)^[15]。

2.3 HB基因的功能

2.3.1调节植物生长发育

Homeobox基因是植物胚胎发育的看家基因之一，在植物早期胚胎径向模式形成以及原表皮细胞分化中起重要作用^[16]。HB基因能影响植物的减数分裂，Xiao等在研究中获得过一种属于植物HD-Finger类的同源域蛋白的拟南芥雄性母细胞致死（MMD1）基因，该基因在雄性减数分裂过程优先表达，研究发现，MMD1基因能调控减数分裂过程中基因表达，MMD1突变体在雄性减数分裂时，会导致植物性母细胞的死亡^[20]。

2.3.2调节植物体的形态结构

在传统的形态学发育进化中，KNOX基因主要通过调节茎顶端分化组织的形成来维持植物的形态^[2]。Kn1基因有决定细胞命运、维持分生组织能力的功能。研究表明，Kn1在玉米分生组织中超量表达，在未展开的茎和腋芽中也有表达，但在叶芽萌生之前就急剧下降。Kn1在烟草中的异位表达可使转化植株产生剧烈的表型变化，包括非正常形状的叶片、叶表面长芽（异位芽）的小叶、顶端优势的丧失和明显的矮化^[21]。Homeobox基因还能引起HB突变，其唯一证据就是大麦的盔状突变，盔状突变引起外稃极性的改变从而出现了额外花。该突变Kn3基因在额外小花原基中的表达，其内含子4中305bp序列连续复制引起的结果^[14][19]。

2.3.3 应答环境胁迫、激素处理等环境信号

对胁迫在内的外界环境信号应答是HD-Zip转录因子特有的生理功能，脱水响应基因LEA启动子区域己发现HD-Zip转录因子的识别位点，表明植物HD-Zip蛋白可能是植物响应脱水胁迫信号转录网络的一员^[15]。有研究表明，拟南芥中的Athb-2/4转录因子参与光敏素有关的光控制形态学发育过程，通过诱导茎的伸长和提高叶绿素含量以适应外界的低光强，黑暗和远红光处理也可以迅速诱导Athb-2/4mRNA的合成^[17]。

Homeobox基因编码的蛋白还与植物抗病性有关^[5]。抑制转基因的番茄H52（一种编码HD-Zip型蛋白的基因）的表达，会产生一种致病的表型，H52在通过限制植物的程序性细胞死亡的蔓延从而保护细胞方面起转录因子的作用^[4]。

Homeobox基因编码的蛋白在可能参与植物对激素的响应。Scarpell等的研究表明，激素对水稻^[23]HB基因Oshox1的表达具有正调控作用，Oshox1的过量表达降低了激素极性运输的敏感性^[19]。向日葵的Hahb-10基因参与赤霉素的传导，并应答向日葵对光质应和光强响应^[20]。GA₃处理可以促进GhHB2/3/4三个基因在棉花种子发育的早期的根、子叶和下胚轴中表达，并据此推测这三个基因介导棉花早期发育的赤霉素传递途径；6-BA可以上调棉花GhHB4基因的表达，表明它与细胞分裂素信号有关^[21]。

2.4 HB基因与芽休眠相关的研究

EduardoGonzález-Grandío等发现，在芽内，TEOSINTE BRANCHED1、CYCLOIDEA、PCF(TCP)转录因子BRANCHED1(BRC1)与三个相关的同源域亮氨酸拉链蛋白(HD-ZIP)编码基因Homeobox protein21(HB21)、Homeobox protein40(HB40)和Homeobox protein53(HB53)结合并正向调控转录。这三个基因与BRC1一起，增强9-CIS-EPOXICAROTENOID DIOXIGENASE3(NCED3)的表达，导致脱落酸积累，触发激素反应，从而抑制芽的发育^[27]。

三．应用前景

HB基因家族在调控植物生长发育，对抗逆境，适应环境中发挥着重要的作用。系统鉴定和分析葡萄HB基因及其在芽休眠中的表达谱，有助于拓宽和加深HB基因家族在植物生长发育过程中作用的认识。相关基础理论研究也能够为葡萄生产提供理论指导，有助于实现葡萄的高效栽培，调整葡萄成熟期，进而延长葡萄供应期，提高果农经济收入。

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

四．研究目标

系统鉴定葡萄HB基因家族，分析其序列和结构特征，进行生物信息学分析，并分析其在芽休眠时期表达量。

五．研究内容

1. HB基因的鉴定

为了便于HB基因家族的研究和结果分析，选择了14个品种，将其分为两组：木本植物（葡萄，桃子，苹果，猕猴桃，梨，杨树，柑橘，木瓜）和草本植物（香蕉，菠萝，拟南芥，水稻，草莓番茄）。对选定的植物进行HB基因家族成员的鉴定。

2. HB基因家族的生物信息学分析

对HB基因家族成员进行生物信息学分析，主要包括检测基因分布情况并计算这些基因的CDS、蛋白序列长度和CDS数量、序列比对和系统发育树分析、蛋白域分析、共线性和Ka/Ks分析。

3. 葡萄HB基因家族成员在非生物胁迫下和芽休眠中的表达分析

从NCBI上获取干旱胁迫，盐胁迫，水涝胁迫和铜胁迫四种生物胁迫的RNA-seq数据，用于进一步挖掘HB基因家族在非生物胁迫下可能的响应性。

利用RT-qPCR技术系统分析葡萄HB基因家族成员在芽休眠中的表达谱。测定的RNA-seq数据，根据RNA-seq数据获得葡萄HB基因的表达谱，获得表达量统计分析和RT-qPCR结果，采用实时荧光定量PCR技术，验证RNA-seq差异表达基因在芽休眠过程中的表达变化。

六．拟解决的关键问题

利用生物信息学方法对HB基因家族进行系统鉴定与分析，利用RT-qPCR技术比较HB基因家族成员在葡萄芽休眠过程中的表达模式是否存在差异。