1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1 课题意义萝卜（raphanus sativus l.）是起源于我国的一种重要根菜类蔬菜作物，为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，不仅营养丰富，而且具有较高的药用食疗价值，在蔬菜生产与周年供应中占有重要地位。
钾是植物生长发育所必需的大量元素,是与氮、磷并列为植物营养的“三大要素”之一。
钾离子作为高等植物所必需的、唯一的一价阳离子,在植物生命活动中对膨压调节、电荷平衡、酶的激活、蛋白质合成等方面,具有极为重要的作用[1-3]。
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2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究目标获得耐低钾萝卜基因型；对萝卜kup/hak/kt家族进行鉴定及相关分析2.2研究内容2.2.1耐低钾萝卜基因型筛选以实验室现存55个萝卜品种为材料，先设定4个低钾浓度，确定适宜低钾浓度。
以筛选出的浓度和正常浓度进行水培，分别在萝卜处理20d和40d后测定相关生理指标以及钾含量。
2.2萝卜kup/hak/kt家族鉴定及相关分析以拟南芥的kup/hak/kt家族蛋白序列作为查询序列，运行blastp检索程序，筛选阈值为1e-10，初步获得大豆kup/hak/kt家族的候选基因。
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3. 研究的方法与方案
3.1研究方法1) 查找文献法文献研究法是根据一定的研究目的或课题，通过调查文献来获得资料，从而全面地、正确地了解掌握所要研究问题的一种方法文献研究法被子广泛用于各种学科研究中。其作用有：①能了解有关问题的历史和现状，帮助确定研究课题。②能形成关于研究对象的一般印象，有助于观察和访问。③能得到现实资料的比较资料。④有助于了解事物的全貌。首先提出课题，然后制定实验计划，再通过知网，万方，维普等平台查找萝卜钾转运蛋白或KUP/HAK/KT家族相关的文献，随后整理文献并进行文献综述。2) 观察法观察法是指研究者根据一定的研究目的、研究提纲或观察表，用自己的感官和辅助工具去直接观察被研究对象，从而获得资料的一种方法。科学的观察具有目的性和计划性、系统性和可重复性。在科学实验和调查研究中，观察法具有如下几个方面的作用：①扩大人们的感性认识。②启发人们的思维。③导致新的发现。使用肉眼、照相机、显微镜对萝卜进行观测，用纸笔对其长度进行观测和记录。3) 实验法实验法是通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果联系的一种科研方法。第一、主动变革性。观察与调查都是在不干预研究对象的前提下去认识研究对象，发现其中的问题。而实验却要求主动操纵实验条件，人为地改变对象的存在方式、变化过程，使它服从于科学认识的需要。第二、控制性。科学实验要求根据研究的需要，借助各种方法技术，减少或消除各种可能影响科学的无关因素的干扰，在简化、纯化的状态下认识研究对象。第三，因果性。实验以发现、确认事物之间的因果联系的有效工具和必要途径。通过设置4个实验组跟1个对照组，控制变量的方式，对待测萝卜进行不同浓度，不同品种的培养液处理，期间要减少无关因素的干扰。以此来进行实验的测定。4）实证研究法实证研究法是科学实践研究的一种特殊形式。其依据现有的科学理论和实践的需要，提出设计，利用科学仪器和设备，在自然条件下，通过有目的有步骤地操纵，根据观察、记录、测定与此相伴随的现象的变化来确定条件与现象之间的因果关系活动。主要目的在于说明各种自变量与某一个因变量的关系。通过实证研究来说明KUP/HAK/KT家族对萝卜生长的具体影响。5）实验数据的统计与分析使用excel，spss等统计软件进行数据的统计、整理及后续的数据分析。3.2 技术路线
2. 研究的目标、内容和拟解决的关键问题2.1 研究目标获得耐低钾萝卜基因型；对萝卜KUP/HAK/KT家族进行鉴定及相关分析2.2研究内容2.2.1耐低钾萝卜基因型筛选以实验室现存55个萝卜品种为材料，先设定4个低钾浓度，确定适宜低钾浓度。以筛选出的浓度和正常浓度进行水培，分别在萝卜处理20d和40d后测定相关生理指标以及钾含量。2.2萝卜KUP/HAK/KT家族鉴定及相关分析以拟南芥的KUP/HAK/KT家族蛋白序列作为查询序列，运行Blastp检索程序，筛选阈值为1e-10，初步获得大豆KUP/HAK/KT家族的候选基因。接着将这些候选基因提交到Pfam数据库进行钾转运子结构域（Pfam02705）验证，最终鉴定出大豆KUP/HAK/KT家族基因成员。然后构建进化树、分析序列结构、染色体定位等。2.3 拟解决的关键问题我国缺钾耕地面积已占总耕地面积的 56%，并呈从北到南缺钾面积逐渐扩大的现象，土壤缺钾已经成为严重影响我国乃至世界农业快速、可持续发展的问题，因此土壤缺钾问题亟待解决。从植物生理学等角度在我国丰富的种质资源中筛选获得具有胁迫耐性的品种，并建立钾高效植物基因库，利用现代分子生物学、遗传育种学、基因工程等生物技术培育出新的耐低钾品种，应用到农业生产中去，以便缓解我国钾素供需矛盾。3. 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析3.1研究方法1) 查找文献法：查阅最近的相关文献，综合考量，确定所选用的待测萝卜品种，所需要测定的指标。2) 观察法最直观的观测指标，用于对实验各组的衡量与测定。3) 实验法对实验各组的相对根长、相对干质量、相对钾含量、相对钾积累量进行试验鉴定，筛选出低钾条件下生长最好的处理组。3.2 技术路线3.3 实验方案：3.3.1耐低钾萝卜基因型筛选3．3.1.1.材料培养与处理将萝卜种子播种于盛有基质的穴盘中育苗，每天用一定量的自来水进行浇灌，以保持一定的湿度。萝卜苗长至两叶一心时，选取长势一致的幼苗，用清水洗净根部基质，用海绵包裹幼苗根茎结合处并固定在 KT 板上，转移至装有清水的塑料周转箱中培养 2d，待缓苗后分处理进行试验。3.3.1.2.筛选浓度确定设定4个低钾处理浓度，分别为0.1、0.5、1.0和2.0mmol/L，钾素供应形态为KCl。随机选取8个萝卜品种分别定植与玻璃瓶中，每个处理5株，用去离子水水培缓苗2d后，将去离子水换成不同钾浓度的营养液进行处理。所述的营养液除钾盐外各成分分别为：Ca(NO3)2 2mmol/L,MgSO4 0.8mmol/L,NaH2PO4 0.4mmol/L,NaNO3 4mnol/L,EDTA-Fe 20μmol/L,H3BO3 10μmol/L,MnCl4H2O 2.5μmol/L,CuSO45H2O0.08μmol/L,ZnSO45H2O0.2μmol/L,H2MoO4H2O 0.1μmol/L。3d更换1次营养液，20d后进行各项指标的测定，确定适宜的低钾处理浓度。培养期间，用0.1mmol/L NaOH或0.1mmol/L HCl调节溶液pH至6.0。3.3.1.3．萝卜耐低钾植株筛选试验分为CK（正常供钾）和LK（低钾）两个处理，正常钾水平营养液K ，低钾水平营养液K ，每个品种的每个处理选取两个KT板（每板15株幼苗）的幼苗进行试验。对照处理营养液K含量跟低钾处理营养液K含量，其他成分相同，3d更换一次营养液，20天后进行各项指标测定，筛选耐低钾植株。3.3.1.4．筛选指标（1）相对根长（relative root length，RRL）：定期拍照，测量萝卜的长宽，观察其生长情况。（2）相对干质量（RPW， relative plant weigh）：将鲜样在105℃杀青30min，80℃烘干至恒重后测干质量相对钾含量（RPC， relative potassium content）：植株样品烘干，磨细后, 经浓 H2SO4 和 H2O2 消煮后用钼锑抗法测钾含量（4）相对钾积累量（RPA， relative potassium accumulation）：由相对干质量和钾含量计算的钾积累量根据相对干质量、相对钾含量和相对钾积累量计算耐低钾指数。耐低钾指=(RPW RPC RPA)/3。3.3.2萝卜KUP/HAK/KT家族鉴定及相关分析3.3.2.1萝卜K 转运蛋白基因的筛选从拟南芥数据库TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥K 转运蛋白序列,以拟南芥K 转运蛋白序列作为查询序列,通过本地BLAST获得萝卜K 转运蛋白候选基因。将获得的候选基因提交到Pfam(http://pfam.xfam.org/)进行钾转运结构域验证，最终鉴定出萝卜钾转运蛋白家族基因。3.3.2.2萝卜K 转运蛋白基因家族成员分析应用ExPASy网站http://web.expasy.org/protparam/在线分析萝卜K 转运蛋白的等电点和分子量。利用 MEGA5.02 软件中的邻接法(Neighbor-Joining method, NJ)构建系统进化树，主要参数设置为基因树稳健性检测, bootstrap 法,1000次重复;距离模型选择 p-distance 和空位缺失数据的处理选择 pairwise deletion。通过 Gene Structure Display 在 线 软 件(https://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因的内含子－外显子结构示意图。提取目标基因集合的启动子序列。提交到PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站进行顺势作用元件预测，将收到的汇总的文件进行整理，筛选并保留有一定查看目的元件。使用TBtools对顺势作用元件进行可视化。根据萝卜基因序列信息，获得每个基因在萝卜染色体上面的位置。通过MapInspect软件绘制基因在染色体上的位置图。3.4可行性分析：从技术层面，对萝卜进行低钾处理在技术上已较为成熟，且也有生产上的诸多应用；从安全角度考虑，低钾萝卜不会对人体造成损害，且萝卜KUP/HAK/KT家族鉴定及相关分析亦对人体无害；从实验室条件来看，也具备进行此实验所需的器材和药品。因此，该方案在操作上以及实际生产时都具有一定的意义。
4. 研究创新点
特色或创新之处（1）前人对于萝卜kup/hak/kt家族的研究较少，属于一个较新的研究方向。
（2）设置多组处理组合，多次测定，既可以对实验结果进行横向对比又可以进行纵向对比，使结论更加全面具体。
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5. 研究计划与进展
.5. 研究计划及预期进展2019.12-2020.3 进行前期材料的准备，文献的查阅2020．3-2020.5．10 进行实验品种的培养，测定2020.5.10-2020.5.20 进行萝卜K 转运蛋白基因的筛选，测定工作2020.5.20-2020.5.26 进行毕业论文的撰写工作
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