1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、课题意义
菊花是世界著名花卉，其观赏价值以及经济价值极高，但在菊花的生产实践中，病虫害问题是影响菊花产业发展的一大障碍。菊花常发生的虫害是蚜虫危害，蚜虫不仅危害菊花，还是tav、pvp等病毒的媒介者（何俊平，2010）。目前对蚜虫的治理主要使用化学方法，但使用农药浪费人力物力，污染环境，且长时间使用会导致蚜虫产生耐药性。因此，发掘抗蚜性相关基因，研发菊花抗蚜新品种是菊花抗性育种待解决的问题。
2. 研究的基本内容和问题
四、研究的目标
在菊花的生产研究中，蚜虫危害是一大难题，通过研究cm4cl2在菊花木质素生物合成途径中的功能，以了解菊花抗蚜性的机制，及为菊花抗蚜性育种做出一定的参考。
五、研究内容和拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
六、研究方法，技术路线，实验方案及可行性分析
1.研究方法与材料
1.1研究材料供试菊花品种‘神马’取自南京农业大学中国菊花种质资源保存中心
1.2研究方法 从切花大菊‘神马’中提取RNA，反转录成cDNA，根据库里的转录组序列设计引物，以cDNA 为模板克隆Cm4CL2基因。进行基因组织特异性表达分析，研究Cm4CL2在4CL家族中的进化树关系，进行超表达载体构建，开展菊花遗传转化，对转基因株系进行通木质素含量测定。
2技术路线
3.试验方案
3.1Cm4CL2基因克隆植物样品总RNA提取采用Trizol法，用RNAisoPlus试剂盒(TaKaRa)进行提取。以RNA为模板，按照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)说明书合成cDNA。(1)依据菊花‘神马’转录组库中的Cm4CL2序列设计引物，采用Phusion高保真DNA聚合酶(ThermoFisher)进行PCR扩增，克隆基因全长。具体反应体系如下。
| 5×Phusion HF | 10 μl |
| dNTPs Mixture (10 mM) | 1.0 μl |
| 上游引物 下游引物 | 1.0μl 1.0μl |
| DMSO | 1.5 μl |
| cDNA | 1.0μl |
| Phusion DNA Polymerase | 0.5 μl |
| ddH2O | 34 μl |
| Total | 50 μl |
(2)扩增结束后经琼脂糖凝胶电泳检测，选取特异性条带进行切胶，纯化，回收目的片段，并对纯化产物进行加尾，体系如下：
| 10×PCR Buffer | 2.5 μl |
| Mg2 (25 mM) | 1.5 μl |
| dNTPs Mixture (2.5 mM) | 2.0 μl |
| 切胶、纯化片段 | 18 μl |
| rTaq (5U/μl) | 1.0μl |
| Total | 25 μl |
(3)用RNAisoPlus试剂盒(TaKaRa)对产物进行提取，纯化，连接于pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株进行测序。
3.2 荧光定量PCR每20 μl qPCR反应液中包含10 μl SYBR Green PCR master mix，上、下游引物各0.5 μM以及10 ng cDNA。加样体系如下：
| SYBR Premix Ex TaqTM II | 10.0 μl |
| Forward primer （10 μM） | 1.0 μl |
| Reverse primer （10 μM） | 1.0 μl |
| cDNA template | 5.0 μl |
| RNase Free dH2O | 3.0 μl |
| Total | 20.0 μl |
把荧光定量板置于Mastercycler ep realplex 2 S（Eppendorf，德国）定量PCR仪中，设置反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，循环数为40个；最后加入溶解曲线程序。每个样品进行重复试验3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，采用2-Ct法进行相对定量。3.3 Cm4CL2组织表达特异性分析选取生长健壮、长势一致的菊花品种‘神马’插穗进行扦插繁殖，待其生根后移栽定植至含蛭石、珍珠岩和营养土(体积比为1∶1∶1)的塑料杯中，在22°C，光照/黑暗中16h/8h条件下培养2周，选取6~8叶龄的幼苗作为供试材料。以长势一致的‘神马’植株为材料，取其根、茎、叶，液氮速冻后保存于-80°C，用于Cm4CL2基因组织定量检测。每个样品重复3次。
序列检索及比对采用BLAST在线程序进行。其他物种中的同源氨基酸序列由NCBI网站下载。采用DNAMAN软件进行序列同源性比对分析。系统发育进化树利用MEGA7.0软件，用最大似然法进行构建，并设置bootstrap重复值为500进行检验。
3. 4载体构建及菊花遗传转化构建Cm4CL2基因超表达载体和功能沉默载体，利用农杆菌介导转化菊花，检测并获得转基因超表达植株以及沉默植株。
(1)得到目的基因全长序列后，对ORF框序列进行酶切位点分析，在起始密码子前加入BamH I酶切位点，在Cm4CL2终止密码子前（不加终止密码子）加入Not I酶切位点。以含有Cm4CL2基因的pMD19-T质粒为模板，进行高保真PCR扩增加了酶切位点的目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化并回收。将纯化产物和入门载体pENTR1A质粒同时进行BamHI和Not I双酶切，37℃酶切2.5 h，具体反应体系如下：
| Plasmid/ PCR DNA | 1.0 μg |
| BamH I | 2.0 μl |
| Not I / Xho I | 2.0 μl |
| 10×Buffer | 4.0 μl |
| ddH2O | up to 40.0 μl |
| Total | 40.0 μl |
(2)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段。将纯化的Cm4CL2片段分别与pENTR1A载体片段进行连接，16℃连接过夜，反应体系如下：
| 目的基因片段 | 2.0 μl |
| pENTR1A载体 | 0.5 μl |
| Solution I | 2.5 μl |
| Total | 5.0 μl |
(3)转化大肠杆菌感受态，挑菌，摇菌，菌液检测，送测序。转摇，提质粒（水加30μL）
(4)构目的载体重组
——将入门载体单酶切（线性化）：
20 μL体系：
| dd H2O | 12 μL |
| Nsi I(或Dpn I) | 1 μL |
| 10X Fast Digest绿色缓冲液 | 2 μL |
| 质粒 | 5 μL |
程序：37 ℃，8h；70 ℃，10 min；4 ℃，∞
扩增结束后经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收。——单酶切后与目的载体重组
5 μL体系：
| 线性化产物 | 3μL |
| 空载体 | 1μL |
| LR重组酶 | 1μL |
程序：25℃，1h；加 0.5μL Proteinase K；37℃，15 min；70 ℃，10 min；冰置3~5 min，转化大肠杆菌感受态（直接用PCR产物转化），涂板，挑菌，摇菌，检测，送测序。
(5)将构建好的植物表达载体通过农杆菌侵染法转化菊花叶片，建立适合供试菊花品种最佳的遗传转化体系在不定芽诱导和生根的过程中用合适浓度的卡那霉素进行抗性苗的筛选，最后通过分子生物学手段检测，获得菊花转基因植株然后炼苗移栽待转化苗生长通过研究外源基因的转录表达水平，记录转基因植株与野生型植株表型的变化。
3.5木质素含量测定木质素含量的测定用Klason 法(Rogers et al， 2005)，含量用%CWR (cell wallresidue)表示。将花颈放入烘箱先105℃杀青0.5h后80℃烘至恒重，取出后充分粉碎。取大约0.5g样品放入丙酮中抽提过夜后烘干。精确称取0.3g千样，加入7.5ml 72%的硫酸，30℃消化3h，期间用玻璃棒搅拌几次，然后用去离子水将消化液稀释至硫酸浓度为4%， 121℃下处理1h，冷却至室温后用玻璃筛过滤，弃滤液，带样品的玻璃筛105℃下过夜烘干，称重后计算木质素含量(%)。
4可行性分析(1)具备完整的实验室平台及实验室设备
(2)具备成熟的试验技术
(3)实验原材料充足
4. 研究创新点
七、特色或创新之处
本研究对菊花‘神马’中的Cm4CL2进行了克隆和功能鉴定。分析该基因在蚜虫接种胁迫下的反应，为进一步开展菊花Cm4CL2基因的功能鉴定，特别是其在应答地上部害虫蚜虫提供初步信息和依据。
5. 研究计划与进展
八、研究计划及预期进展 2018年9月 - 2018年12月：进行菊花‘神马’cm4cl2基因克隆
2018年12月- 2019年2月：不同组织、响应蚜虫取食中的表达特性分析
2019年3月-2019年7月： 超表达载体构建，遗传转化，转基因菊花鉴定2019年9月-2020年1月： 进行木质素含量测定2020年3月-2020年 5月：数据整理，论文撰写。
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