1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.研究意义
菊花（chrysanthemum）原产我国，多年生菊科草本植物，其花瓣呈舌状或筒状。菊花是经长期人工选择培育的名贵观赏花卉，也称艺菊，品种达三千余种。是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏和经济价值极高。其种质资源丰富，蕴含着丰富的遗传变异，许多重要观赏性状为复杂的数量性状。而花期又是影响植物生产的重要观赏性状之一，根据花期迟早，菊花可以分为秋菊、寒菊和夏菊等3种类型。
本课题利用菊花srap 、scot等分子标记技术分析切花菊群体结构和连锁不平衡水平、种质资源的遗传传多样性，并且在此基础上采用全基因组关联分析法进行花期性状关联分子标记的发掘。本课题可发掘出大量与花期性状相关联的分子标记，进一步探索菊花优异基因资源，为菊花新品种培育的亲本选配和分子设计育种提供重要的理论依据。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
(1) 探索与切花菊花期性状显著关联的分子标记。
(2) 研究切花菊种质资源的群体结构与连锁不平衡水平。
(3) 发掘切花菊种质资源的遗传多样性。
2.研究内容 |
(1) 全基因组分子标记与关联分析
对研究群体利用本课题组建立的SRAP、SCoT等分子标记技术体系进行全基因组分子标记扫描，并且分析群体的遗传多样性与标记位点间的连锁不平衡水平。检测群体结构，发掘与花期性状相关联的标记。
(2) 群体花期性状多年、多点观察统计 |
对研究群体花期性状进行观察统计，获得可靠的性状数据。
3.拟解决的关键问题 如何进行群体内处于连锁不平衡状态的分子标记与花期性状变异间的关联情况？ 本研究拟对实验的切花菊品种采用课题组建立的普适性较好、条带非常丰富的SRAP和SCoT两种分子标记进行全基因组扫描分析，可以提高关联分析的分辨率。并采用TASSEL 3.0的GLM程序进行分子标记与花期性状的关联分析，发掘显著相关的分子标记。 |
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
选择改良CTAB法提取实验所有切花菊品种的基因组DNA，并用SRAP、SCoT等分子标记进行全基因组分子标记扫描，获得分子标记数据。利用随机区组方法进行田间试验设计以及形态学观察法并结合统计方法鉴定多年、多点的花期性状。数据分析则采用EXCEL和SPSS软件进行表型性状基本描述性数据处理，分子标记与花期性状的关联分析可采用TASSEL 3.0的GLM程序进行，群体结构和标记连锁不平衡分析可采用STRUCTURE 2.2和TASSEL 3.0等软件进行。
2.技术路线（见附件） 3.实验方案 (1) 全基因组分子标记扫描 对CTAB法（Murray Thompson 1982. Nucleic Acid Res 8: 4321-4325）进行适当改良后，取嫩叶提取切花菊的基因组DNA。 ① SCoT分子标记：优化菊花SCoT-PCR反应体系，以8-10份切花菊材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，筛选36个引物中条带数适中，条带清晰且多态性好的引物。 ② SRAP分子标记：利用已优化好的菊花SRAP-PCR反应体系（张飞 等，2009）。以8-10份切花菊材料的基因组DNA为模板，筛选由25条正向引物和20条反向引物组成的500对SRAP引物组合中的多态性引物。参照Zhang et al.（2011）方法，采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。 以95份切花菊品种种质资源的基因组DNA为模板，分别利用上述筛选出的多态性SRAP和SCoT引物进行全基因组分子标记扫描；根据PCR扩增产物的电泳结果，在凝胶的某个相同迁移率位置上有DNA条带的记为1，无DNA条带的记为0，选择重复性好、清晰可辨的谱带进行统计，建立原始矩阵，并计算引物的多态性性信息含量（Polymorphism information content，PIC）等参数。 (2) 田间实验与表型性状鉴定 以95个切花菊品种，来源于日本、欧洲、美国及我国等、无直接亲缘关系，观赏性状各异的自然群体为材料。在江苏、海南两个试验点进行试验，以随机区组设计进行田间试验，每品种每小区随机选择10株登记其花期性状，连续统计两年两点的数据，进行平均值及变异系数等基本描述性数据统计。 (3) 遗传多样性分析 利用SRAP和SCoT分子标记数据采用Popgene v1.32软件分别、计算多态性位点数、多态位点百分率等遗传参数。利用Mantel测验检验两两标记数据类型得出的相似性系数矩阵与表征矩阵之间的差异程度。用类平均进行聚类分析，构建系统进化树。 (4) 群体结构与连锁不平衡水平 首先，参照STUCTURE v2.3软件和Tassel v3.0软件的数据要求，对上述分子标记的原始1, 0矩阵重新赋值，以进行下一步数据处理。利用TASSEL v3.0软件估算标记位点间的连锁不平衡水平（Linkage disequilibrium，LD），计算标准不平衡系数（D），D的理论变化范围是0~1，通常，D小于0.5作为LD衰减的标志。绘制LD配对检测的矩阵图，D值大小在配对检测的矩阵图上用相应色差大小给予直观反映。 然后，根据Pritchard等方法（2010）应用STRUCTURE v2.3软件中的Bayesian方法对研究材料进行基于数学模型的类群划分。先设置群体数目 K值，并假定位点都是独立的，然后根据似然值最大的原则选取一个合适的K值，并计算供试材料相应的Q值（第i个材料其基因组变异源于第k群体的概率）。绘制群体结构表征图，从而确定研究材料的群体结构类型。 (5) 分子标记与花期性状关联分析 利用TASSEL软件的GLM（General Linear Model）程序，在鉴定的花期性状及群体结构和连锁不平衡水平分析的基础上，以各个体Q值作为协变量进行群体矫正，然后将花期性状表型鉴定数据对SRAP和SCoT分子标记变异进行回归分析。估算分子标记位点等位变异表型效应，计算公式为 ai=∑xij/ni－∑Nk/nk（式中ai代表第i个等位变异表型效应值，xij 为携带第i个等位变异的第j材料性状表型测定值，ni为具有第i等位变异的材料数，Nk为携带无效等位变异的第 k个材料的表型测定值，nk为具有无效等位变异的材料数）。若ai值为正，则认为该等位变异为增效等位变异，反之为减效等位变异。 4.可行性分析 （1）理论可行性：目前，关联分析为主要的分析数量性状手段，并且已经在异交及无性繁殖的多个物种多种数量性状的分析成功的应用，尤其是对于重要品质性状关联分子标记发掘的研究。所以采用关联分析法开展高度杂合、无性繁殖的菊花的数量性状研究理论依据充分。 2）具有特色的研究材料：本课题组收集保3000余份菊花及其近缘种属植物，从六五以来一直从事菊花种质资源收集、整理、评价与利用的研究，建有中国菊花种质资源保存中心。本研究以95个切花菊品种，来源于日本、欧洲、美国及我国等、无直接亲缘关系，观赏性状各异的自然群体为材料，符合关联分析对自然群体的要求，利于优异基因资源的挖掘。 |
4. 研究创新点
1.研究的特色 本课题组率先建立了适用于菊花的SCoT标记技术体系，该标记是一种基于单引物扩增反应（SPAR）的新型分子标记，产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记；多态性丰富，操作简单。利用SRAP、SCoT多种分子标记技术，以提高研究结果的可靠性；对本研究拟定的数量性状相关分子标记挖掘将采用关联分析法进行，该方法是目前主要作物和部分园艺植物数量性状分子遗传研究的有效手段。因此，本项目在研究手段和方法上具有很好的创新性。
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5. 研究计划与进展
1.研究计划
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