菊花脑离体再生植株研究开题报告

1.1 选题意义

菊花脑（Chrysanthemum nankingense Hand）为菊科（Compositae）菊属多年生宿根草本植物，是我国特有的菊属野生二倍体物种。由于其生育期较短，繁殖容易，作为二倍体，遗传背景相对简单，又是栽培菊花的近缘野生种之一，因而是研究菊属植物进化的理想材料，具有开发为菊属植物基因表达研究的模式材料的潜在价值。其嫩茎、叶具有特殊的清香味,可炒食或汤食,营养丰富,含有多种人体必须的氨基酸、纤维素以及大量的微量元素。此外,菊花脑对人体有很好的药用保健功能,可消暑、解渴、润喉、清热、凉血、调中健脾、开胃、降压、解毒,并可用于辅助治疗各种皮肤病,是一种极具药用价值的保健蔬菜。更含有黄酮类和挥发油等芳香物质，浓郁的芳香味，对病原微生物有较强的抑制作用。因此，具有重要的研究价值。通过构建菊花脑再生体系，可以：

1.1.1利于快速繁殖

菊花脑的传统繁殖方式为种子育苗、分株栽植和扦插繁殖。但长期采用分株法繁殖容易引起种性退化，产量下降。与之相比，组培因条件可控不受季节限制，可全年连续生产，能以28d左右增殖5-7倍的速度在组培室内繁殖小苗，比传统的扦插方法快，而且运用组培的方法能获得大量规格统一的花苗，为规模化生产提供了种苗保证。此外,还解决了因长期采用分株繁殖导致种性退化、产量下降的问题，为菊花脑的规模化生产提供了可能。

1.1.2应用于基因工程

分子育种克服了常规育种中远缘杂交困难、周期长的种种限制，为定向改良植物品种提供了新的手段和途径。而遗传转化只有建立在良好的组织培养再生体系的基础上才能成功(贾士荣和曹冬孙，1992)。一种的高效再生体系要求具有较高再生频率和分化率, 且具稳定性、重复性。自Hill(1968)利用芽尖外植体通过愈伤组织诱导成株建立菊花再生体系以来,许多学者以叶片、茎段、管状花、花梗等为外植体相继建立了菊花的离体再生体系。原生质体培养和体细胞胚培养再生体系也获得了成功。但由于菊花转基因存在对基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、随机性大、转化细胞不易成苗等问题，因此针对不同类型菊花品种建立相对应的再生和遗传转化体系，已成为大规模菊花分子育种首要解决的问题。

菊花(Chrysanthemum morifolium)作为世界上最重要的商品切花之一，其再生体系的建立已经有很多报道。所用的外植体包括叶片、茎段、花瓣、花托和舌状小花。K.Tanaka 和Y.Kanno(2000)曾观测到菊花放射状小花外植体的体细胞胚状体发生, 并从胚状体上分化出芽体。Roest 和Bokelmann(1975)报道了从菊花叶片和茎段上分化出不定芽。Bush(1976)用菊花的花瓣为外植体, 建立再生体系, 并通过体细胞变异获得新的变种。司怀军和戴朝曦等(1998)以菊花幼嫩花瓣作为供体材料,MS作为培养基,获得菊花的再生植株。高亦珂等以地被菊矮黄、玉龙和传统菊花金背大红的叶盘和茎段为外植体进行再生培养, 建立菊花的再生体系, 并进行转基因的操作。Urban曾用叶盘为外植体获得了转基因植株。

经过大量的检索阅读，发现专一的针对菊花脑这一品种的遗传转化及再生体系构建的研究至今报道很少。因此作者希望以菊花脑为组培实验对象，对其再生能力进行了系统深入研究，建立高效稳定的再生体系,为开展菊花脑的分子育种及相关研究奠定基础。

1.3 应用前景

应用于菊花脑的规模化生产：可全年连续生产，能以28d左右增殖5-7倍的速度在组培室内繁殖小苗，获得大量规格统一的花苗，为规模化生产提供了种苗保证。

应用于基因工程：解决了菊花转基因存在对基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、随机性大、转化细胞不易成苗等问题，为利用插入突变构建菊花脑突变体库等大规模菊花分子育种做准备。

有利于其他菊属植物再生体系构建的研究。

2.1 研究目标

菊属植物所在的菊科植物是被子植物中最大的一个科，属种数和个体数均为被子植物之首，遍布全球各地，是被子植物中最丰富的一个类群。本实验的实验材料菊花脑(Chrysanthemum nankingense (Hand.-Mazz.) Y. R. Ling)是我国特有的菊属野生二倍体物种。本研究拟通过选取菊花脑不同的器官组织为外植体，设置多种激素组合与不同浓度梯度，构建二倍体菊花脑的再生体系，为进一步培育转基因菊花脑植株，鉴定和筛选转基因植株并建立菊花脑突变体库做准备。

2.2 研究内容

(1) 通过选取菊花脑不同的器官组织为外植体进行培养，确定出最适宜作为再生体系起始点的外植体

(2) 通过设置多种激素组合与不同浓度梯度，确定菊花脑再生体系不同培养阶段的最适培养基配比。

(3) 通过实验中培养条件和处理方法的测试，确定再生体系的最适培养条件和处理方法。

2.3 拟解决的关键问题

(1) 确定出最适宜作为再生体系起始点的外植体

(2) 确定菊花脑再生体系不同培养阶段的最适培养基配比。

(3) 确定再生体系的最适培养条件和处理方法。

3.1研究材料

二倍体菊花脑种子（南京农业大学中国菊花种质资源保存中心）

自然条件下每年连续生长的菊花脑植株（南京农业大学菊花基地）

3.2研究方法

以菊花脑的不同器官为外植体，包括：叶盘，茎表皮，下胚轴，以不同的生长调节剂组合进行组织培养。对于叶盘和茎表皮，在愈伤诱导阶段选取三种生长素（NAA、IBA和2,4-D）同6-BA组合，筛选最具有分化潜力的愈伤组织。在分化培养阶段选取三种细胞分裂素（TDZ、IBA和KT）同NAA组合，比较分化率和再生苗的差异，筛选出最佳分化培养基。对于下胚轴，在愈伤诱导阶段选取两种生长素（NAA、2,4-D）同6-BA组合，筛选最具有分化潜力的愈伤组织。在分化培养阶段将高浓度的6-BA同低浓度的NAA组合，筛选最佳分化培养基。

3.3技术路线

3.4实验方案

3.4.1以叶盘、茎表皮为实验材料

1）培养菊花脑组培幼苗（南京农业大学菊花种植资源保存中心），扩繁至20瓶左右

2）配制含不同梯度激素配比的培养基

诱导愈伤（生长调节剂浓度单位为mg/L）

叶盘：菊花脑组培苗生长至30天时，选取植株中上部叶片，去掉边缘，切成约0.5cm0.5cm的叶盘，正面向上接种在培养基内。愈伤诱导至25天时，挑选、切分长势良好的愈伤，将其转入分化培养基。诱导愈伤阶段每处理接种30个外植体，诱导分化阶段每处理接种20个外植体，均重复三次。

茎表皮：菊花脑组培苗生长至30天时，选取植株中上部幼嫩茎段，削取长约0.8~1.0cm的表皮，接种于培养基内。愈伤诱导至25天时，挑选、切分长势良好的愈伤，将其转入分化培养基。诱导愈伤阶段每处理接种40个外植体，诱导分化阶段每处理接种27个外植体，均重复三次。

4.特色或创新之处

（1）首次以菊花脑为材料，进行再生体系的构建。

（2）首次选取大量外植体，取材丰富，包括菊花脑的茎表皮、叶盘、下胚轴，可能比较出更适宜作为菊花脑再生体系材料的外植体。

（3）根据预实验，发现菊花脑切割茎段时常残留茎节处腋芽组织，影响实验结果准确性，因此采用不含腋芽组织的茎段表皮为外植体。

5.1研究计划

2012.09~2012.12 以下胚轴为外植体，构建菊花脑再生体系

2013.01~2013.04 以茎表皮、叶盘为外植体，构建菊花脑再生体系

2013.05~2013.07 撰写开题报告和文献综述

2013.12~2014.04 论文的撰写及答辩

5.2预期研究成果

（1）建立出完善菊花脑再生体系。

（2）发表1~2篇论文。