不结球白菜中SKP1基因的克隆及VIGS功能验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.国内外研究概况

s期激酶相关蛋白1(s-phasekinase-associatedprotein1,skp1)是真核生物中普遍存在的一类蛋白，通常与cdc53p/cul1f-box形成scf复合体参与泛素蛋白降解途径。能够调控细胞循环、生物节律、生物抗逆性以及雄性不育等许多重要过程[1]。如拟南芥atskp1基因在茎尖、花序、根的分生组织及叶原基和花原基等分裂旺盛的组织中呈现高水平表达，在这些分裂活性高的部位atskp1基因的mrna高度累积，因此atskp1基因可能是植物细胞维持分裂活性所必不可少的[2]；另研究表明拟南芥中skp1蛋白参与的scf复合体在生长素响应途径中也起着重要作用[3]；西红柿的skp1蛋白与尖孢镰刀霉菌的frp1基因互作，frp1蛋白对于该菌的致病性是非常重要的，所以skp1蛋白对于西红柿抵抗枯萎病的发作至关重要[4]；大豆包囊线虫侵染大豆可诱导大豆skp1基因的转录，skp1可能参与大豆抵御线虫的侵染[5]；skp1基因与n-基因介导的抗烟草花叶病毒(tmv)病相关[6]。

病毒诱导的基因沉默（virusinducedgenesilencing,vigs），是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源目的基因沉默，与对照相比，进而有效研究目的基因的功能。vigs技术具有方法简单、适用范围广以及获取结果迅速等优点，已成为研究功能基因组学以及特定基因功能的有效工具[7]。vigs克服了传统转化方法所带来的诸多困难，能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通过vigs载体测序和鉴定[8]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

研究不结球白菜中skp1基因的克隆以及运用vigs的方法进行基因功能的验证。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

（1）引物设计

根据genbank中已发表的大白菜skp1基因的cdna全长序列和ptrv2的特点，设计skp1基因vigs功能验证的上游引物skp1es(5-cggcccatatgtcc tcctcaaagatgatc-3)下游引物skp1ea(5-gccgcctcgagctcaaatgc ccaagcatt-3)，分别在skp1es和skp1ea的5c端引入了ndei和xhoi酶切位点，另在下游引物的酶切位点后面去掉目的基因的终止密码子以产生融合有his标签的融合蛋白，引物间距为470bp。

4. 研究创新点

VIGS技术能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通过VIGS载体测序和鉴定。VIGS避免了植物的转化表达过程。

目前研究表明，SKP1基因能够调控细胞循环、生物节律、生物抗逆性以及雄性不育等许多重要过程。本实验通过VIGS新的基因功能验证手段，探究不结球白菜SKP1基因的生物学功能。

5. 研究计划与进展

2013年09至10月，完成skp1基因的克隆，及载体构建。

2013年11至12月，完成vigs功能验证。

2014年01至05月，处理数据，撰写毕业论文。