1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
随着大量基因序列和est资料的积累，后基因组时代诞生了。
功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容，主要研究生物有机体内各种基因的生物学功能，进而了解所有基因如何协调发挥作用，完成一系列的生长发育过程。
要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用，必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标： （1）为不结球白菜的离体再生体系的优化以及转基因提供基础和依据； （2）筛选可利用的不结球白菜突变体资源。 2.研究内容： （1）农杆菌介导建立不结球白菜变异题库； （2）筛选突变体及突变体的鉴定。 3.拟解决的关键问题： （1）组培法进行筛选和再生时的难度克服； （2）所用的载体在不结球白菜突变体库构建中尚属首次。 |
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1.研究方法 （1）种植、测定、筛选 （2）组培实验 2.技术路线及实验方案 （1）材料准备 不结球白菜四九菜心 （2）转化及组培 所用培养基： 蔗糖30g/L 琼脂粉7.5～8g/L 发芽：1/2 MS 预培养：1/2 MS 2mg/L 6-BA 0.3mg/L NAA 共培养：1/2 MS 2mg/L 6-BA 0.3mg/L NAA As（667μl/L） 分化：1/2 MS 0.3mg/L NAA 0.5mg/L TDZ 7.5mg/L AgNO3 500mg/L Carb 筛选：1/2 MS 2mg/L 6-BA 0.3mg/L NAA 500mg/L Carb 0.5mg/L PPT 生根：1/2MS 0.1mg/L NAA or 1mg/L IBA 以上所用培养基均附加蔗糖3%，琼脂6g/L 具体过程 1. 种子消毒（约30min）将种子置于消毒过的100ml的烧杯（或50ml塑料管）中，然后加入大约20-30ml的酒精，处理30s后，弃酒精。 注：种子的品质非常重要，如果种子有内生菌，将会极易污染，灭菌步骤只能灭掉种子表面的菌类；消毒液的体积约为需要消毒种子的8~10倍。 2. 然后加入20-30ml的5%次氯酸钠溶液（或0.1%升汞），盖上封口膜，缓慢晃动，消毒约15min。 3. 弃次氯酸钠溶液，用灭过菌的蒸馏水清洗种子约5次，每次加入25-35ml的蒸馏水晃动约30s。注：这一步以及以下所有步骤均在通风橱内操作。 4. 将种子倒在一消过毒的培养皿内，待用。种子萌发（约4d）。 5. 用镊子将灭过菌的种子转移到包含种子萌发培养基的平板上，每板约20粒种子。注：此步建议使用培养瓶；每皿过多的种子将增加取出发芽后种子的难度。 6. 室温，黑暗中培养1d，然后光周期12 h，培养3 d。注：有文献报道说黑暗或弱光（~650lux）萌芽的种子比有光萌芽的种子的外植体更易转化成功。外植体预培养（约2d）。 7. 将幼苗从萌芽培养基中取出，置于空的培养皿上。 8. 用消过毒的锋利的手术刀切下子叶，包含约2mm的叶柄。注：避免带上生长点。 9. 将外植体转接到预培养基上，室温，12h光周期培养2d。注：若一批有大量外植体，分批切下并及时转入培养基上，避免外植体失水。农杆菌准备（约4d）。 10. 种子萌芽步骤2 d 后，进行农杆菌的准备。划线携带载体的LBA4404菌株于2-3个包含100μgml1 rifampicin 和50μgml1 kanamycin 的LB平板上（ 28℃孵育2d）。 11. 从平板上挑取单克隆置于10ml包含有100μgml1 rifampicin 和50 μgml1 kanamycin的YEB液体培养基中，28℃ 振荡 (250rpm)培养36h。 12. 使用分光光度计测量OD600。 13. 离心菌液4℃，4000rpm，10min，以50ml MS悬浮菌斑，加入As 667μl/L（终浓度100μmol/L），悬浮均匀后离心，弃上清，再以50ml MS悬浮菌斑，振荡培养0.5-1h。 14. 用液体MS培养液重悬沉淀，并用其调整菌液OD600至0.4~0.5。农杆菌侵染和共培养（约2d）。 15. 将预培养后的外植体（步骤9）取出，加入农杆菌悬浮液中（步骤14）侵染5min。 16. 将侵染过的外植体置于吸水纸上，稍微吸除表明菌液后，置于共培养液培养基上（上铺一层滤纸），将截面贴于纸面，用3M 封口膜封好培养皿。25℃，暗培养2d。芽诱导（约4-5 周）。 17. 将外植体转移至包含500mgL1 carbenicillin 的愈伤诱导培养基。3M封口膜封好培养皿。25℃，光周期12h 培养1周。 18. 将外植体转入包含500mgL1 carbenicillin 的芽诱导培养基上生长，25℃，16h，~3,300lux 光照约4周。注：培养2 周后，更换新的芽诱导培养基。由于品种差异性，这一步骤可能需要的时间不同，少则2-3周。芽生长（约2-4周）。 19. 将再生芽切下，转入包含500mgL1 carbenicillin 和10mgL1 kanamycin的芽生长培养基，25℃，光下（16h）培养2-4周。 (3)筛选 1. 培养2 周后，更换新的芽生长培养基。期间切下生长较好的芽（2-4cm长），以促进芽的进一步生长。转化筛选（约2-3周）。 2. 将芽转入含糖量较低（10 gL-1），较高kanamycin（15~20 mgL1）和500 mgL1 carbenicillin 的转化选择培养基中（使用培养瓶）。确保芽的基部嵌入培养基中。每瓶置5个左右。25℃，微光下培养2-3周。这一步主要是淘汰非转基因或假阳性芽，从而筛选出转基因芽。（注：每瓶内不要太拥挤。确保芽的截面很好地置于培养基中。每个芽要很好地从愈伤组织上分离下来，携带的愈伤组织可能产生新的非转基因或假阳性芽）根诱导（约2周）。 3. 将筛选后仍然绿色的芽转入含有500 mgL1 carbenicillin 根诱导培养基，确保基部很好地置于培养基中。25℃光下培养2 周。注：因品种差异，这步可能需要更长的时间3-4周。温室驯化及移栽（约2周）。 4. 将根系生长良好的植株的瓶盖打开，适应培养约1周，要保持好植株的水分。 5. 将植株从培养瓶中取出，用微温的水清洗掉残留的琼脂。 6. 将植株栽入已经润湿好的营养基质中。 7. 将栽好的植株放入湿度较高的培养箱中生长1周，之后可移入普通温室中。 |
3.实验结果分析： 对于实验前期穴盘苗的种植，我们选择多植优选的方法，力求保障实验的顺利进行，对于后期得到的变异题库材料，我们会进行仔细筛选，确保实验结果的真实性和可靠性。 4.可行性分析 （1）对各种试验方法有一定的了解； （2）对实验器材有一定的熟悉度。 |
4. 研究创新点
特色或创新之处 |
在拟南芥变异题库成功构建以及水稻的T-DNA插入构建变异体库的参照下，不结球白菜的变异体库的构建有利于离体培养再生体系的优化及抗病转基因研究。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展 2013年10月2013年11月 实验材料的准备与实验前准备 2013年11月2014年01月 组培实验 2014年01月2013年02月 组培结果鉴定与分析 2014年02月2014年04月 分析结果，撰写论文 |
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