美国蜡杨梅（Myricacerifera）和石斑木（Rhaphiolepis indica）抗盐机理的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本项目主要进行适应于江苏省滩涂地区观赏植物美国蜡杨梅(myricacerifera)、石斑木(rhaphiolepisindica)的抗盐筛选和生理指标测定，例如生物量、光合作用等；并对不同生理指标的意义作初步探讨；同时研究它们的繁殖、耐盐抗盐的分子机理，例如膜透性、mda含量以及渗透调节物质的种类和含量对植物抗盐性的指示意义。研究结果将直接推进对滩涂土地资源的开发及观赏植物的引入。

1、研究意义

江苏海岸带位于我国沿海地区的中东部，地理位置优越，战略地位非常重要。岸线平直，海岸类型齐全：沙质海岸分布于海州湾的北部，岸线长30.625km；基岩港湾型海岸分布于连云港市，岸线长0.2483km；其余均为粉砂淤泥质平原海岸，岸线长883.0625km，约占全国的一半。其特点是岸滩及潮沟系统冲淤活跃，连片分布，潮间带发育较好，滩地宽广，最宽处可达20-30km。滩涂面积居沿海各省区之首，现有面积近70万hm，占全国滩涂面积的30%左右，相当于全省土地总面积的6.5％，并以每年l300hm的速度继续向海淤涨。因此，用好这片极具开发价值的后备资源，对缓解江苏用地日益紧缺的矛盾，推动沿海经济发展，具有十分重要的意义。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

拟通过对石斑木和蜡杨梅抗盐、耐盐的研究，筛选出优良的抗盐、抗盐品种株系，并大量繁殖；并试种于江苏沿海滩涂，使大面积滩涂利用起来。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

盆栽所选植物,用不同浓度梯度的海水稀释液浇灌所栽植物一段时间后测量该植物的各项生理指标

实验方案

1.主要研究方法

1.盆栽试验

2.生理指标测定

①叶绿素测定

②电导率测定

③土壤电导率测定

④相对含水量的测定

⑤细胞渗透势测定

⑥游离脯氨酸测定

⑦可溶性糖含量测定

⑧丙二醛(MDA)含量的测定

⑨可溶性蛋白测定

2.方法

2.1盆栽试验：

盐分胁迫处理:采用NaCI溶液，分对照、低盐浓度、中盐浓度、高盐浓度等4个水平，盐度依次为0(适宜盐分条件CK)、3(轻度胁迫T1)、6(中度胁迫T2)、9(重度胁迫T3)。

每个处理水平重复3盆，一共12盆

2.2生理指标测定

(1)叶绿素测定

1取新鲜叶片擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀

2称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加入少量石英砂、碳酸钙粉及95%乙醇2-3ml，研磨至匀浆，再加入95%乙醇10ml左右，继续研磨至组织变白，静置3-5min

3取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒将提取液缓缓倒入漏斗中，过滤至25ml棕色容量瓶中（或用锡箔纸包裹避光），用少量95%乙醇冲洗研钵，研棒，残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中

4用滴管吸取95%乙醇，将滤纸上叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸残渣中无绿色为止，用95%乙醇定容至25ml摇匀

5将叶绿素提取液倒入比色杯，以95%乙醇为空白，测665nm、649nm、470nm下的吸光度(g/125ml)

计算：Ca=13.95A665-6.88A649

Cb=24.96A649-7.32A665

Cxc(类胡萝卜素）=（1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

(2)电导率测定

1取新鲜叶片0.5g，剪成1cm大小片段，去离子水洗涤3次，以去除表面电解质，吸干水分

2将叶片放入刻度试管中，准确加入10ml蒸馏水浸没叶片。

3将试管放入真空干燥器（凡士林密封干燥器），用抽气机抽气40min左右，重新缓缓放入空气，使叶片下沉。取出静置30min，时、随后用玻棒轻轻搅动，测定电导率EC1

4测毕，将试管放入沸水浴15min，取出后放入自来水中冷却10min，测定EC2(根部电导率测定同上）

计算：电解质的相对外渗率=(EC2/EC1)x100%

(3)土壤电导率测定

1将土壤砸碎风干，过1mm筛，称取20g置于150ml干燥三角瓶中，加入蒸馏水100ml（水土比5:1），震荡5min，过滤于干燥三角瓶中（用抽滤瓶进行过滤直至清澈滤液）

2吸取土壤浸提液30ml,置于50ml小烧杯中，测量电导率

(4)相对含水量测定

1选取完全展开的幼叶，避开主脉剪下半个叶片，用锡箔纸包好，防止脱水（每个样品生物学重复3次）

2分别称取鲜重FW干重DW饱合重TW

干重：85℃烘箱内烘干48h称重

饱合重：叶片浸泡在蒸馏水中24h称重

计算：相对含水量RWC=100(FW-DW)/(TW-DW)

(5)细胞渗透势测定

1去同一部位叶片立即浸入去离子水中饱和8h，取出叶片后用去离子水冲洗干净，洗净表面水分，立即放入液氮

2将叶片组织置于医用注射器，室温融化，用力挤压注射器，挤出约0.5ml汁液即可，使用FM-8P型全自动冰点渗透压计测定细胞溶质渗透摩尔浓度

(6)脯氨酸测定

1将叶片剪碎混合，称取0.2-0.5g放入大试管中，加入5ml3%磺基水杨酸溶液

2加盖玻璃球，放在沸水浴中浸提10min

3取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加入2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min

4取出后冷却后加入5ml甲苯充分震荡30s，以萃取红色物质，静待分层后吸取甲苯层在520nm下比色，于脯氨酸标准曲线比对得出脯氨酸含量

显色液：1.25g茚三酮溶于30ml冰乙酸，20ml6mol/L磷酸中搅拌，加热溶解（低于70℃），置于棕色瓶中4℃保存，可使用2-3天

3%磺基水杨酸：称取3g用蒸馏水溶解定容至100ml

脯氨酸标液：25mg脯氨酸，蒸馏水溶解定容至250ml，取此液10ml蒸馏水稀释至100ml即为10ug/L标液

Ps:标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制：取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

（3）6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用移液器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

(7)可溶性糖测定

1称取剪碎混合均匀的新鲜叶片0.1g,放入刻度试管中，加入10,ml蒸馏水，塑料薄膜封口，放入沸水浴中煮沸30min，

2取出冷却过滤，置于25ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗数次残渣，定容

3吸取样品提取液0.5ml于刻度试管中，加入1.5ml蒸馏水（另有试管加2ml蒸馏水做空白对照）摇匀

4再加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml浓硫酸，充分震荡，立即放入沸水浴中，试管均准确保温10min（水浴重沸后计时），取出后迅速冷却至室温，以空白作参比，620nm下比色

蒽酮乙酸乙酯：1.0g蒽酮，溶于50ml醋酸乙酯中，冷却至室温，贮存于棕色试剂瓶，4℃保存，可使用2-3周

葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）

Ps:按下表配置系列浓度的标准葡萄糖溶液，然后吸取0.5ml标液加入1.5ml蒸馏水，再加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml浓硫酸，充分震荡，立即放入沸水浴中，试管均准确保温10min（水浴重沸后计时），取出后迅速冷却至室温，以0号管为作参比，620nm下比色

表24-1蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

(8)MDA测定

1称取剪碎混合均匀的新鲜叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸(TCA)2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸（TCA）进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液

2取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml0.6％硫代巴比妥酸溶液(TBA)。

3摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再4000r/min离心10min。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。

10%TCA：10g三氯乙酸用蒸馏水溶解，定容至100ml

0.6%TBA：6gTBA用10%TCA溶解定容至1L（先用少量1mol/LNaOH溶解）加热至70℃才能溶解

计算：

A450=（85.410-3）C糖

（A532－A600）=（15510－3）CMDA （7.410－3）C糖解得：

C糖=11.71A450（mmolL－1）

CMDA=6.45（A532－A600）－0.56A450（μmolL－1）

公式中：A450在450nm波长下测得的吸光度值

A532在532nm波长下测得的吸光度值A600在600nm波长下测得的吸光度值

﹡1.55105

为摩尔比吸收系数

C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。

(9)可溶性蛋白测定

1称取剪碎混合均匀的新鲜叶片0.25g-0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆

28000r/min低温离心15min，取0.2ml-0.3ml上清液，加蒸馏水补至1ml，加入试管中

3再向试管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，室温静置2min后在595nm下比色

标准蛋白溶液：称取牛血清蛋白25mg,加蒸馏水溶解定容至100ml，吸取上述溶液40ml，稀释至100ml

考马斯亮蓝：称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml90％乙醇中，加入85％的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。

标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／Ml)的绘制：

取6支具塞试管，按表2－1数据配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白质液各1ml。

表2－1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表

在每支试管中加入5ml考马斯亮蓝G－250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2min后，用1CM光径比色杯在595nm下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

计算：样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝CVTV1FW1000（2-2）

式中C：查标准曲线值(μg)；

VT：提取液总体积(Ml)；

ＦW：样品鲜重(g)；

V1：测定时加样量(Ml)

可行性分析

本项目指导老师将从美国引入美国蜡杨梅和石斑木，在植物抗盐、耐盐机理研究、组织培养方面具有丰富的研究与实践经验。此外，与上述方案有关的实验方法都是成熟的研究方法，实验所需的关键仪器设备，在我院实验中心已全部具备，所以本项目所拟方案是切实可行的，完全能够达到预期的研究目标。

4. 研究创新点

（1）美国蜡杨梅和石斑木首次在中国引种和在盐渍土壤上试种。

（2）不仅进行实验室实验，同时到江苏沿海滩涂进行实地实验。

（3）研究本项目将提高我们探索新事物、研究新事物的能力，提升我们的创新精神与团结合作的精神；在研究过程中，我们将理论与实际相结合，有利于我们综合素质的提升及自身的发展。

5. 研究计划与进展

2012.10～2013.4所选植物的沙藏,打破植物种子休眠，植物种子栽植发芽生长；

2013.5～2013.8植物移栽花盆内生长壮大，之后用盐水处理；

2013.8～2012.10正式进行实验研究，所选盐生植物的生理指标测定，例如电导率，光合作用等；