秋水仙素诱导野生草莓杂交后代染色体加倍开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

草莓（fragaria ananassa duch.）是对蔷薇科草莓属植物的通称，属多年生草本植物。中国是世界上野生草莓（fragaria viridis）资源最丰富的国家，长白山山脉、大兴安岭蕴藏着种类和数量极为丰富的野生草莓^[1]。野生草莓在提高栽培品种抗逆性、抗病性、芳香性、固形物含量等方面有较大潜力，因此国外很多学者进行了草莓种间杂交以获得新类型新品种^[2,3]。我国进行该项研究较晚，雷家军等所做的草莓种间杂交证明了绿色草莓（fragaria viridis duch.）和东北草莓（fragaria mandschurica staudt）杂交可以获得较高的结实率^[4]。国内研究人员大多用东北草莓与凤梨草莓或黄毛草莓杂交，随后进行加倍处理^[5]，本实验对绿色东北草莓进行加倍尚属首次。

果树多倍体育种工作开展较早，从1937年莱克斯里等人用秋水仙素(colchicines)处理曼陀罗获得多倍体开始，半个世纪以来，果树育种学家对多种果树进行了多倍体育种的研究，到目前为止，已在梨、苹果、葡萄、草莓、柑橘、枣、猕猴桃、核桃等树种上成功育出了多倍体植株^[6]。多倍体植物由于染色体加倍，其外部形态特征和二倍体有明显的差别，主要表现在根、茎、叶的形态和大小上^[7]。

秋水仙素是微管特异性药物^[8]，由于适宜浓度的秋水仙素，能破坏纺锤丝的形成，因此可使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍^[9]。用秋水仙素诱导多倍体时，通常是用秋水仙素溶液浸泡或点滴处理分生组织，从而获得多倍体，所用浓度一般在0 .01 % -0 .4 %^[10]。近年来, 随着植物组织培养技术的发展，越来越多的植物可以通过组织培养再生植株，这使得秋水仙素在离体组织水平上诱导细胞内染色体加倍成为可能。离体组织细胞染色体加倍也以其容易控制实验条件和重复实验结果，提高工作效率，减少嵌合体等优势而逐渐受到重视。利用该法通过调整亲本的倍性，对克服远缘杂交的不孕性、远缘杂交的不实性、创造远缘杂交育种的中间亲本及培育作物新品种等方面具有积极的作用^[11]。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标

1.1成功利用秋水仙素诱导绿色草莓和东北草莓种间杂交后代（lsdb-11-01、lsdb-11-02、lsdb-11-03)的加倍。

1.2探索秋水仙素诱导上述种间杂种草莓染色体加倍的技术方法。

3. 研究的方法与方案

1.技术路线

2. 实验方案

2.1 材料选取

绿色草莓和东北草莓杂交获得子一代杂种草莓，对其栽培获得充足的幼苗，从中选取优质植株作为实验材料。

2.2 大量扩繁

2.2.1为了探索杂种草莓三个株系的培养基中6-BA的最适浓度，进行分组实验。培养基配方：MS 琼脂（30g/L） 蔗糖(5.8-6.0g/L) NAA(0.1mg/L) 6-BA,6-BA设置三个浓度梯度，分别为0.6,0.8,1.0（mg∕L）。9种组合各做10瓶，进行继代培养，一段时间后由丛生芽数量确定最优6-BA浓度。若结果不理想,则重设浓度梯度再次探索。

2.2.2在确定最适的培养基浓度后，经过3至4次继代培养之后，获得充足的实验材料。

2.3秋水仙素诱导加倍

2.3.1操作获得足够的茎尖，进行杂种草莓三个株系的染色体加倍实验，诱导试剂为秋水仙素。为获得秋水仙素的最佳诱导浓度范围，先做预实验。秋水仙素浓度分别为0，0.10%，0.15%，0.20%，0.30%。处理茎尖时间分别为24h，36h，48h，72h(放置在振荡器中)，随后对茎尖进行组织培养。培养基的配方：MS 琼脂（30g/L） 蔗糖(5.8-6.0g/L) 6-BA（1.0mg/L） NAA(0.1mg/L)。

每个株系每个浓度各做10瓶，一段时间后统计诱导率和成活率以获得较适诱导浓度范围及处理时长。

2.3.2用较适诱导浓度的秋水仙素处理杂种草莓三个株系的茎尖合适的时间进行加倍后，把处理过后的茎尖放在培养基中进行培养。

2.4 倍性鉴定及加倍后培养观察

2.4.1采用流式细胞仪对秋水仙素处理后的茎尖进行倍性鉴定。记录并统计诱导加倍率。

2.4.2把成功加倍的幼苗移栽到高锰酸钾消毒过的基质中，随后炼苗驯化培养，探索四倍体幼苗的适宜培养条件。

2.4.3待幼苗稍大后观察统计四倍体草莓的生物学性状。

3. 可行性分析

3.1牌楼实验基地提供了充足的杂种草莓组培苗，为本实验的顺利开展提供了条件。

3.2园艺学院果树研究实验室能够提供良好的实验硬件和实验环境。

3.3熟练掌握了植物组织培养和秋水仙素加倍的实验方法和操作步骤。

4. 研究创新点

本实验研究材料杂种草莓由绿色草莓和东北草莓两种野生二倍体草莓杂交获得，在此之前利用秋水仙素诱导其加倍的实验还未有人做过。因此，本实验是首次利用秋水仙素对杂种草莓进行加倍的研究。

5. 研究计划与进展

1. 研究计划安排

2013年7月，得到充足的二倍体草莓幼苗。

2014年1月，确定出最适的秋水仙素浓度范围，开始加倍实验