基于葡萄果皮颜色多样性对vvmybA1和vvmybA2基因型的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

葡萄属于葡萄属（vitis），为落叶藤本植物。浆果多为圆球形或椭圆球形，色泽随品种而异。人类在很早以前就开始栽培葡萄，产量几乎占全世界水果的四分之一；其营养价值和经济价值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒等。

果皮颜色是葡萄的一个重要经济性状,也是葡萄育种中的一个重要选择指标。葡萄颜色大致可以分为黑、红、白色。花色苷使葡萄果皮呈色，在果皮中花色苷总量以及其不同的组成比例（构造差异）对浆果与葡萄酒的颜色至关重要,能够提高两者的感官品质。黑色和红色果皮的葡萄品种在果皮内积累花色苷，而白色果皮的葡萄品种不能在果皮内合成花色苷，其实质是由于有关基因发生了突变，导致了合成色素有关基因的丢失。

在葡萄中，myb类基因作为转录因子通过控制类黄酮糖基转移酶（udp-glucose：flavonoid3-o-glucosyltransferase，ufgt）基因的表达调控花青素的生物合成，myb类调节基因对花色苷的生物合成以及葡萄果皮着色起着至关重要的作用。不同的myb类调节基因的基因型及其单倍型决定了极大多数葡萄品种的果皮色泽。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标：

通过采集葡萄样品，提取样品葡萄dna，pcr扩增样品dna、检测扩增片段等手段得到不同果皮颜色葡萄对应的yba1，了解myb类调节基因位点基因型及其与果实色泽之间的关系。为育种和鉴定检测工作提供新方法。

二、研究内容：

3. 研究的方法与方案

（一）研究方法：

（1）文献研究：查阅相关参考文献，了解葡萄果皮着色机理；了解VvmybA1及VvmybA2基因的生物信息学特性，推断其基因、基因型和变异可能导致的葡萄果皮颜色变化；了解相关相关报道，了解实验具体操作。

（2）实验研究：本项目即以拟实验，完成VvmybA1及VvmybA2基因的提取、检测以及比对和分析其对应的葡萄果皮颜色。

（二）技术路线：

试验将于于2014.6-2015.3进行在南京农业大学进行。对若干个欧美杂种（Vitislabruscana）和欧亚种（Vitisvinifera）葡萄品种进行基因检测。采摘幼嫩叶片立即用液氮处理，保存于-80℃条件下备用。

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

CTAB提取缓冲液的经典配方

1、Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

2、EDTA螯合Mg2 或Mn2 离子，抑制DNase活性；

3、NaCl提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

4、β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

CTAB提取缓冲液的改进配方

1、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

2、PVP按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。

具体操作：

（1）基因组DNA提取方法

1)CTAB β-巯基乙醇60ul于2ml离心管中→植物材料液氮中研磨→65℃预热30min，每10min振荡一次

2)加三氯甲烷750ul→涡旋→12000rpm，20min离心

3)取750ul上清液于新的1.5ml离心管中→加70ul无水乙醇、35ulNaAc→涡旋→12000rpm，5-7min离心

4)取700ul上清液于新的2ml离心管中→加700ul冰冻处理的异丙醇→上下震荡40次→-20℃，30min沉淀保存

5)12000rpm，5min离心→弃上清液→70%乙醇（70ul无水乙醇 30ulddH2O）洗DNA），上下震荡2min→干燥→55ulddH2O→-20℃保存

（2）PCR

6)ddH2O灭菌；

7)引物离心，空离5min，用小离心机；

8)稀释引物，OD100μL=ddH2O；

9)按以下体系进行混样，先不加DNA；

10)于小管中取好DNA，加入混样，稍离心，放入PCR仪中进行扩增；

11)制作琼脂糖凝胶，扩增结束后进行电泳，获得条带，紫外透射仪上观察拍照。

配制以下20μL体系：

Primer10.8μL

Primer20.8μL

10buffer2μL

dNTP0.8μL

rTaq0.2μL

H2O14.4μL

DNA1μL

PCR议设置：

94℃94℃Tm72℃72℃4℃

5min30s30s30s10minTm管壁：（上游Tm 下游Tm）/2 2~4=Tm（PCR）

Cycles

PCR循环次数在32~36个，具体视情况而定。

（三）实验方案：

查阅国内外文献资料；实验；归纳总结；撰写论文；答辩

（四）可行性分析：

课题立项明确，目标清晰，研究成果具有较强针对性和实用性，具有广泛的应用空间，即课题研究内容有价值；

资料查阅充分，前人对这一领域研究主要为理论部分，具体结论等比较少，即该课题具有创新性和研发性；

实验室器材、仪器、设备充足，满足提取DNA、特异性扩增DNA、检测DNA的必要条件，及该课题可以被顺利实施；

综上，课题具有顺利实施的条件，实验结果有价值。

4. 研究创新点

对于育种工作来讲，可以将得到的结论（Myb具体基因型对应什么具体葡萄果皮颜色性状）应用于育种工作中（葡萄果实色泽分子设计转基因葡萄）；或者通过鉴定检测等手段，在葡萄幼苗果品颜色的品种选择上更为方便、高效和准确。

对于葡萄品种鉴定及检测工作来说，可以在非葡萄果实着色期就可通过分子检测了解其决定果实颜色的相关基因型，从而快速、高效准确地了解其未来果皮颜色，为育种的删选工作做出贡献。

5. 研究计划与进展

2014.5与导师进行沟通，确定毕业论文方向。

2014.5-2014.6查阅相关资料，搜集毕业论文原始资料，期间多和导师、师兄师姐进行沟通。

2014.6搜集资料，编写开题报告。