1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1 研究意义
植物细胞中，nadph氧化酶生成的ros与其它信号分子交织在一起，形成一个网络系统，参与生长发育和各种生物、非生物胁迫信号转导。近年来大量研究表明：作为一个多基因家族，不同的rboh基因存在组织分布、基因表达和活性调控模式的差异，执行着不同的功能。从不同植物中克隆新的rboh基因将有助于更多的了解其功能及活性调控的信息。然而，植物中rboh基因方面的研究主要集中在双子叶模式植物（如拟南芥、烟草等），关于重要植物大蒜rboh基因方面的研究尚无报道。
玻璃化(hyperhydricity)是植物组织培养及基因遗传转化过程中普遍存在的现象，在草本植物和木本植物中普遍发生。目前已见报道的易发生玻璃化现象的植物有80多种，实际发生玻璃化的植物远远超过150多种，几乎涵盖了所有的重要经济植物，一些植物玻璃化率甚至高达100（wu et al., 2009; 陈兵先等, 2011；mohammad rubel, 2013）。玻璃化试管苗呈现半透明水浸状，其组织结构和生理功能异常，分化能力低下，难以增殖成芽，也难以生根成苗，移栽后成活率低，后期生长差，成为植物组培脱毒快繁、基因遗传转化、种质资源创新和次生代谢产物形成的严重障碍之一(陈兵先等, 2011; huang et al., 2011; 吴震等, 2011；coste et al.,2011; sahar et al., 2012）。
2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究目标
克隆大蒜呼吸爆发氧化酶基因asrboh，研究rboh基因在试管苗玻璃化进程中的表达模式和大蒜试管苗玻璃化的关系从而对大蒜试管苗玻璃化进行有效预防和控制。
2.2 研究内容
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
①试验材料培养
研究用大蒜品种为二水早，保存于南京农业大学园艺学院。在蒜薹的花茎发育相对高度（花茎高度/假茎高度）为1，花序轴上表面直径为0.5cm时，将总苞带2cm薹段剪下进行处理。将剪下的蒜薹总苞置于饱和洗衣粉溶液中浸泡20min，然后再用自来水冲洗30min。将充分冲洗的蒜薹总苞置于超净工作台上，以70酒精进行表面消毒30s，2次氯酸钠溶液浸泡消毒12min后，再用无菌水冲洗5次。剥去外层苞叶，去除花茎部分及花序轴表面退化的花原基残留物和膜质苞片。将花序轴纵切为4块，接种于初代培养基（B5 6-BA 1.0mg/L 0.65琼脂 3蔗糖）上，置于温度25℃、光照时间12 h/d，光照强度约为90μmolm-2s-1的条件下培养。待诱导出生长一致的丛生芽后选取生长一致的丛生芽进行处理。
②AsRBOH全长的扩增
利用简并引物扩增基因，测序后得到中间片段；
③ AsRBOH全长特征的分析
④ AsRBOH基因表达特征的分析
3.2 技术路线（见附件） 3.3 实验方案 3.3.1总RNA的提取(Trizol法) 取实验材料，在液氮中研磨，加入1ml 裂解液RZ，匀浆处理。将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。4℃ 12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。加入200ul的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃ 12000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃ 12000rpm离心30s。向吸附柱CR3中加入500ul去蛋白液RD，4℃ 12000rpm离心30s，去废液。向吸附柱CR3中加入700ul漂洗液RW，室温静置2min，4℃ 12000rpm离心30s，去废液。向吸附柱CR3中加入500ul漂洗液RW，室温静置2min，4℃ 12000rpm离心30s，去废液。将吸附柱放入2ml收集管中，4℃ 12000rpm离心2min，去废液，将吸附柱CR3置于超净台上干燥。将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加入30-100ul RNase-free ddH2O，室温静置2min，4℃ 12000rpm离心2min，-70℃保存。 3.3.2 引物的设计 根据已报道或登录GenBank的其他植物Rboh氨基酸序列设计引物，扩增中间片段，再根据扩增得到的中间片段设计3/5RACE引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 3.3.3 大蒜Rboh的扩增 3.3.3.1 单链cDNA的合成 按下列组成配制反转录反应液。
70℃ 10min，冰上放置5min。
稍微离心，42℃，1h；70 ℃，10min。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3.3.2 中间片段的扩增
反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；62℃，1min；72℃，1min；28个循环；72℃，10min。 3.3.4 3RACE 上述获得的片段回收后测序，根据的已测得的大蒜Rboh基因中间片段测序结果，设计两条正向嵌套引物KO3′GSP1和KO3′GSP2。 3.3.4.1 单链cDNA的合成 按下列组成配制反转录反应液。
70℃ 10min，冰上放置5min。 在上述反应液中加入以下反应液。
稍微离心，42℃，1h；70 ℃，10min。 3.3.4.2 第一轮PCR反应体系及扩增程序如下：
反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；61.2℃，1min；72℃，1min；30个循环；72℃，10min。 第一轮PCR产物稀释10倍作为模扳进行第二轮巢式扩增。 3.3.4.3 第二轮PCR反应体系及扩增程序如下：
反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；58.1℃，30s；72℃，1min；28个循环；72℃，10min。 扩增产物在1.2琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。 3.3.5 5RACE 3.3.5.1 单链cDNA的合成 按下列组成配制反转录反应液。
70℃ 10min，冰上放置5min。 在上述反应液中加入以下反应液。
42℃，1h，70℃ 5min。 3.3.5.2 cDNA的纯化 先将Wizard DNA Clean-Up Resin 37℃ 温育10min，冷却至25-30℃待用。在合成单链cDNA中加入75μL水，再加入1ml Wizard DNA Clean-Up Resin，充分混匀。将Syringe Barrel与Luer-Lok连接，将Ⅱ中混合液加入到Syringe Barrel中，真空抽滤。在Syringe Barrel中加入2ml 80的异丙醇，真空抽滤。丢弃Syringe Barrel，将Luer-Lok与1.5ml管连接，在Luer-Lok中央加入50μL DEPC水，静置1min。1000rpm离心30s。 3.3.5.3 cDNA的末端加尾 按下列组成配制反转录反应液。
94℃ 3min，冰上放置5min；加入1μL TdT酶；37℃反应30min，65℃ 10min灭活TdT。 3.3.5.4 第一轮PCR反应体系及扩增程序如下： 按下列组成配制1st PCR反应液（模扳为cDNA末端加尾产物）。
反应程序为：94 ℃，5min；94 ℃，30s；55.3 ℃，30s；72 ℃，1min；28个循环；72 ℃，10min。 3.3.5.5 第二轮PCR反应体系及扩增程序如下： 按下列组成配制2nd PCR反应液（模扳为第一轮PCR产物）。
反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；28个循环；72℃，10min。 3.3.6 目的片段的回收 回收的目的片段连接到pMD19-T载体上，连接产物转化进入感受大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑接种于4ml含100μgL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中。37℃ 250rpm振荡培养过夜。取菌液进行PCR扩增（扩增体系见上），扩增产物在1.2琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。 TA克隆体系：
反应程序：16℃，过夜。 3.3.7 序列测定及分析 序列测定由南京金斯瑞科技公司完成。利用美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站中的BLAST对获得的核苷酸和推导的氨基酸序列进行同源性比对及保守结构域分析（http//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），由ORF Finder（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gf/gf.html）分析开放阅读框；使用MEGA4软件绘制系统进化树；使用ProtParam tool（http//www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析氨基酸基本成分；运用PBIL LYON-GERLAND对CKO进行二级结构预测（http//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automatpl?page/NPSA/npsa_hnn.html）；用TMHMMServer v.2.0程序（http//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白序列跨膜区分析；用在线软件PSORT（http//pst.ims.u-tokyo.ac.jp/fm.html）进行亚细胞定位。采用SWISS-MODEL（http//swissmodel.expasy.g/wkspace/index.php?funcmodelling_simple1）对蛋白质立体结构进行预测。 3.3.8 qRT-PCR qRT-PCR采用SYBRpremix EXTagTMreagent试剂盒（Takara），操作按试剂盒说明进行。融解曲线测定为从65 ℃到95 ℃，反应在Rot-Gene 3000实时定量PCR仪上进行。实验设3次重复，实验数据由Rot-Gene Real-Time Analysis software6.1和Excel2007软件分析。按相对定量法进行基因表达量的计算，相对表达量的比值2-△△C，△△Ct△Ct测定样品-△Ct校准样本，△Ct测定样品Ct测定样品目标基因-△Ct测定样品参照基因，△Ct校准样本△Ct校准样本目标基因-△Ct校准样本参照基因。正常样品为校准样本。 qRT-PCR反应体系如下：
反应程序：95 ℃，2min；94 ℃，20s；50 ℃，20min；72 ℃，20min；45个循环；72 ℃，10min。 3.4 可行性分析 （1）本项目既有科学依据，又有实践证据，在理论和实践上是可行的。 （2） 本项目有成熟的技术支撑，在研究方法上是可行的 所在实验室具备该项目完成所需的大型仪器设备。本人已掌握了本研究涉及的克隆基因所需的材料和相关指标测定等技术。
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4. 研究创新点
4.1 本实验特色
长期以来，有关试管苗玻璃化研究多集中在试管苗玻璃化过程中的各类生理指标变化，而缺少对基因等分子方面的深层分析。本研究立求从基因诱导的水平，系统的揭示试管苗玻璃化发生过程中的分子机制，这是本研究的特色之一。
4.2 本实验创新之处
5. 研究计划与进展
5.1 年度研究计划
（1）2014年06月2014年12月
基因中间片段的扩增；3race
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