1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 茶树[Camellia sinenesis(L．)0．Kuntze]，山茶科、山茶属的多年生常绿木本植物。是我国传统的出口商品，茶产业是我国丘陵山区农业产业结构调整和高效农业建设的一个重要组成部分，也是效益明显的优势产业和特色产业。在传统农业向现代农业转化过程中，现代高新技术显现出越来越强的支撑作用。[1]其中，龙井茶作为中国著名绿茶，有着两百多年历史，其色绿、香郁、味甘、形美四绝的特点深受消费者的喜爱，本实验采用的龙井长叶属于适制龙井茶的一个优良品种，且其作为旱生、优质的绿茶品种，以其为研究对象对茶树的新品种的选育和改良有着重要意义。 涝害是世界上大多数国家面临的重大自然灾害之一。 据估算，全球湿涝耕地约占总耕地面积的 12％［2］。我国以黄淮平原和长江中下游的涝害最为严重，约占全国受灾面积的3／4以上［3］，洪涝灾害极大地限制了这些地区的植物分布和作物产量，筛选和培育耐涝性强的植物材料，成为涝害土地利用急需解决的问题，同时也是扩大具有高经济效益的农作物种植范围的有效手段。因此，作为我国重要经济作物的茶叶，研究其在涝害胁迫下的生理特性，对其耐涝性改良和机理研究等有着重要意义。 目前对作物耐涝性的研究较多，研究层面从形态到生理甚至基因调控，采用的研究材料也种类繁多。随着耐涝性研究的不断深入，涝害胁迫下作物外部形态、内部结构的适应性变化、生理生化指标的动态变化及抗涝性指标的选择、不同品系间抗涝性的比较选择、分子水平的探讨，以及如何采取有效的预防措施最大限度减轻涝害损失等方面，都已展开全面研究，并且获得了长足的进展［4~9］。 本实验采用葸酮比色法测定可溶性糖含量[10],酸性茚三酮显色法测定游离脯氨酸含量[11],硫代巴比妥酸测定丙二醛含量[12],氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[13],愈创木酚法测过氧化物酶（POD）活性[14],通过研究龙井长叶在涝害胁迫下的可溶性糖、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、脯氨酸、丙二醛活性等生理指标的变化为筛选适宜的抗涝栽培品种提供依据，减少生产中的损失，培养栽培户的积极性[15]，有助于龙井长叶的推广，为进一步研究提供基础。同时也为今后其他新品种茶叶的抗逆性研究提供理论依据。 |
参考文献 [1]余素红, 洪永聪, 曾明森, 等. 分子生物学技术在茶树科学研究中的应用与展望[J]. 茶叶科学技术, 2009, (2): 5-10. [2] Li J C． Waterlogging physiology of wheat and its relation with wheat productivity [J］． Plant Physiol Commun，1997， 33（4）：304－312． [3] 时明芝，周保松．植物涝害和耐涝机理研究进展［J］．安徽农业科学，2006，34（2）：209－210． [4]刘永贤，曾祥难，周晓，农梦玲，欧清华．水涝胁迫对烟草生理生化特征影响的研究进展［J］．广西农学报，广西农业科学434,2007,22（1）:32－33,38． [5]陈永军，王泽杰，谢崇华，杨国涛．水稻苗期不同水分胁迫下抗氧化指标的变化［J］.西南农业学报，2009,22（2）：286－289． [6]陈永华，赵森． 不同淹涝胁迫强度对杂交稻和常规稻农 艺性状和生化特性的影响［J］ ． 中国水稻科学，2006， 态平衡 20（5）：512－516． [7]王芳，赵团结，盖钧镒．大豆野生与栽培资源苗期耐淹性的鉴定、生态区特征和优异种质发掘[J].大豆科学,2007,26（6）:828－834． [8]赵伟，李林，戈蕾，王丹，刘登望．不同花生品种幼苗期 耐涝性差异分析［J］.贵州农业科学，2009，37（12）：84－ 86． [9]陈永华，赵森，柳俊，严钦泉，肖国樱．水稻耐淹涝性状 的遗传分析和SSR 标记的研究［J］.遗传，2006, 28（12）:1562－1566． [10]Yemm E W, Willis A J.The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone [J]. Biochemical Journal, 1954, 57: 508-514. [11]王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].2 版.北京:高等教育出版社, 2008: 134-135, 190-191, 278-279. [12]Dhindsa R,Plumb-Dhindsa P, Thorpe T. Leaf senescence: correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation,and decreased levels of superoxide dismutase and catalase [J]. Journal of Experimental Botany,1981, 32: 93. [13]Giannopolitis C N, Ries S K.Superoxide dismutase.I.Occurrence in higher plants [J].Plant Physiology,1977, 59: 309-314. [14]Chen Q, Yang L M,Ahmad P, et al. Proteomic proling and redox status alteration of recalcitrant tea (Camellia sinensis) seed in response to desiccation [J]. Planta,2011,233: 583-592. [15]范川，李贤伟等.老鹰茶苗木耐涝性与抗寒性研究[J].四川农业大学，2007 |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
以龙井长叶为实验材料，茶园耕层土壤为培养基质，按照水淹没根茎以上35 cm做处理，每6天取样测定茶树的丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、过氧化物酶（pod）、超氧化物歧化酶（sod）等五个指标，以研究涝害胁迫对龙井长叶生理特性的影响。
研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法
实验室试验分析
技术路线
查阅相关文献 |
龙井长叶的培养 |
涝害胁迫处理 |
对照试验 |
论文撰写 |
数据分析 |
POD |
SOD |
丙二醛 |
脯氨酸 |
可溶性糖 |
1.实验材料和处理方法
1.1实验材料
1.1.1 植物材料：龙井长叶茶苗
1.1.2 培养基质：茶园耕层土壤，最大持水量40%
1.2 处理方法
涝害按照水淹没根茎以上35 cm做处理，以正常浇水后1 d后作为涝害胁迫基点，处理时间分别为1(CK)，7，14，21d，每6 d取样。
用UV一2300型紫外可见分光光度计测定吸光值，每个样品测定3次，取平均值。
2.相关指标的测定
2.1 愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性
2.1.1 试剂
①0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH5.5）。
②0.05 mol/L 愈创木酚
③2% H2O2
④20%三氯乙酸
2.1.2 实验步骤
①酶液提取
取植物叶片（视需要定，去叶脉）0.25 g于预冷的研钵中，1 mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆（研磨时添加0.1 g PVP），加缓冲液使终体积为5 mL，于4000 rpm下离心10 min，上清液即为SOD粗提液。取1 mL粗酶液稀释至10 mL
②POD测定
加热煮沸5min的酶液对照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2.0mL终止反应，然后过滤（或5000r/min离心10min）适当稀释，470nm波长测定吸光度
反应体系为：0.05 mol/L 磷酸缓冲液 2.9mL
2%H2O2 1.0mL
0.05 mol/L 愈创木酚 1.0mL
0.1mL酶液
2.2 氮蓝四唑（NBT）法测定茶叶中超氧化物歧化酶（SOD）活性
2.2.1 试剂
①0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）。
②130 mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 mL。
③750 μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 mL，避光保存。(氮蓝四唑用离心管锡箔纸包装，-20℃保存)
④100 μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721 g EDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000 mL。
⑤20 μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000mL避光保存。
2.2.2 实验步骤
①酶液提取
取植物叶片（视需要定，去叶脉）0.25 g于预冷的研钵中，1 mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆（研磨时添加0.1 g PVP），加缓冲液使终体积为5 mL，于4000 rpm下离心10 min，上清液即为SOD粗提液。取1 mL粗酶液稀释至10 mL。
②显色反应
取5 mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加各溶液：
试剂（酶） | 用量/mL | 终浓度（比色时） |
0.05mol/L 磷酸缓冲液 | 1.5 | |
130mmol/L Met溶液 | 0.3 | 13mmol/L |
750μmol/L NBT溶液 | 0.3 | 75μmol/L |
100μmol/L EDTA－Na2液 | 0.3 | 10μmol/L |
20μmol/L 核黄素 | 0.3 | 2.0μmol/L |
酶液 | 0.1 | 2支对照管以磷酸缓冲液代替酶液 |
蒸馏水 | 0.2 | |
总体积 | 3.0 |
混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4 000 Lx日光下反应20 min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。不加酶液的试管颜色较深。
③SOD测定 至反应结束以后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他各管的吸光度
2.3 茶叶中可溶性糖含量的测定
2.3.1 试剂
①蒽酮乙酸乙酯试剂：1g蒽酮溶于50mL乙酸乙酯中，储存于棕色瓶中，在黑暗中保存
②浓硫酸（相对密度1.84）
2.3.2 实验步骤
2.3.2.1 标准曲线的绘制
①1%蔗糖标准液：在80%下烘至恒质量，精确称取1.000g，加少量水溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容到刻度
②100μg/L 蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取200mL刻度试管11支，从1~10分别编号，按表加入溶液和水。然后加入0.5蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分震荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比。在630nm下测其吸光度，以糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标曲，求线性方程。
试剂 | 管号 | |||||
0 | 1、2 | 3、4 | 5、6 | 7、8 | 9、10 | |
100μg/L 蔗糖液/mL | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水/mL | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 |
蔗糖量/μg | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
2.3.2.2 可溶性糖的提取
取鲜叶0.5g，剪碎，加入蒸馏水5mL，于沸水浴上浸提30min（2次），过滤入10mL容量瓶中，摇匀。
2.3.2.3 测定
吸取样品提取液1mL,加1mL蒸馏水，之后同上。
2.4 茶叶中脯氨酸含量的测定
2.4.1 试剂
①酸性茚三酮溶液：将1.25 g茚三酮溶于30 mL冰醋酸和20 mL 6 mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。（酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配）。
②3％磺基水杨酸配配制：3 g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100 mL。
③冰醋酸 ④甲苯
2.4.2 实验步骤
2.4.2.1 标准曲线
①称取25mg脯氨酸，用少量蒸馏水溶解，倒入250mL容量瓶中
②取6个50mL容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，浓度分别为1、2、3、4、5、6μg/mL
③取6支试管，分别吸取2mL脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min
④冷却后加入4mL甲苯，震荡30s，静置
⑤用注射器轻轻吸取上层脯氨酸甲苯溶液至比色皿中，以甲苯为空白对照，于520nm测其吸光度。
⑥标曲绘制
2.4.2.2 测定
①脯氨酸提取 取叶片0.5g加入3%磺基水杨酸5mL在沸水浴中浸提10min（边提边摇动），冷却后过滤
②吸取2mL提取液，加入2mL冰醋酸及2 mL 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30 min，溶液即呈红色。冷却后加入4 mL甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻。
③用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520 nm波长处测定吸光度（A）值。
2.5 茶叶中丙二醛含量的测定
2.5.1 试剂
①5％三氯乙酸(TCA)。
②0.67％硫代巴比妥酸（TBA）：用10％的三氯乙酸定容。（现用现配）
2.5.2 实验步骤
①提取：取植物叶片0.5 g于预冷的研钵中，加5%TCA 5 mL（3 mL用于磨样，2 mL用于洗涤研钵），研磨后所得匀浆在3000 rpm下离心10 min。
②取上清液2 mL，加0.67％ TBA 2 mL，混合后在100 ℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次。
③分别测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值。
3. 数据分析
采用Excel软件作图，邓肯氏新复极差测验进行差异显著性分析。
可行性分析
（1）课题构思合理
本课题是建立在对其他作物的涝害胁迫的研究基础之上的。植物对涝害胁迫的初期反应是气孔关闭,CO2的扩散阻力增加,;起着淹涝时间的延长,与光合作用相关的酶活性逐渐降低;叶绿素含量下降,叶片早衰,绿叶面积减少,根内GA和cTK合成受阻,加剧叶片脱落死亡。涝害也会引起叶绿素含量及Chl/Chlb的变化。研究涝害胁迫下茶树生理指标的变化可以了解茶树在进化进程中演化出的抗涝机制，为提高茶树品种抗涝性提供了可能。本课题构思合理，方法可行。
（2）目前作物涝害方面的研究已取得一定成果，为本实验提供理论指导
目前对作物耐涝性的研究较多，研究层面从形态到生理甚至基因调控，采用的研究材料也种类繁多。随着耐涝性研究的不断深入，涝害胁迫下作物外部形态、内部结构的适应性变化、生理生化指标的动态变化及抗涝性指标的选择、不同品系间抗涝性的比较选择、分子水平的探讨，以及如何采取有效的预防措施最大限度减轻涝害损失等方面，都已展开全面研究，并且获得了长足的进展。因此为实验提供了足够的理论依据与数据支持，相应指标的测定也能得到很好的理论指导。
（3）拥有良好的研究基础
所在实验室在茶树研究方面已取得一定成就，能提供相应理论指导和设备支持。且本人对茶学有着浓厚的兴趣，对茶树生理生化领域的研究有一定的了解。申请者已查阅了大量相关的文献，对其它品种茶树抗涝性的研究进展有初步的了解。
4. 研究创新点
首次研究了龙井长叶这个品种茶树的抗涝性，本实验通过测定在涝害胁迫下龙井长叶相关生理指标的变化，了解龙井长叶这个品种的抗涝机制，为今后增强龙井长叶的抗涝性以及筛选抗涝品种提供依据，从而减少生产中的损失，培养栽培户的积极性，有助于龙井长叶的推广。同时也为今后其他新品种茶叶的抗涝性研究提供数据参考。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2015年03月2015年06月查阅文献，确定课题方案，准备所需仪器材料
2015年07月2015年09月进行预备试验，修订试验参数
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