RNase T2诱导梨花粉管死亡的毒理学分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

梨是典型的蔷薇科植物，大多数品种都具有自交不亲和性（self-incompatibility，si），自花授粉不能结实。

自交不亲和性是植物雌蕊的柱头或花柱可以辨别自体花粉或s基因型相同的异体花粉，并抑制其萌发或生长的一种特性。

它使得自体受精不能实现，只有遗传组成不同的异体花粉才能完成受精，是显花植物促进异交、防止近亲繁殖和保持遗传变异的一种特性。

2. 研究的基本内容和问题

主要通过RNase T2诱导梨花粉管死亡的毒理学分析，运用利用花粉管线粒体分离技术、线粒体膜电位测定技术、透射电镜、蛋白免疫印迹、荧光标记等方法研究在花粉离体培养过程中外源RNase T2对花粉细胞分子结构及生物活性的影响，从而到达探究梨花粉管死亡过程中生长收到抑制并最终导致其死亡的原因和该过程中的信号传递路径。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法梨花柱s-rnase与外源rnase a、rnase t1、rnase t2的n端氨基酸序列有高度的同源性。

已有研究证实,花柱 s-rnase就是抑制自花花粉管生长的特异性物质，但外源rnase t2对花粉管生长有何影响却少有报道。

本研究将外源 rnase t2添加于培养基培养花粉，对rnase t2诱导梨花粉管死亡的机理进行毒理学分析。

4. 研究创新点

目前有关梨自交不亲和性机理的研究主要集中在有关雌蕊自交不亲和s基因的克隆及其产物的表达特性、分离纯化及功能花粉表达的f-box基因的鉴定等分子机理研究领域。

但是研究表明高等植物si反应的信号系统仅揭示最初导致花粉管停止生长的原因，而导致花粉管死亡的机理还比较少。

根据毒理学相关概念，当内源或外源毒物损害细胞时，细胞内部会产生一系列维持损害的机制，包括atp耗竭、细胞内ca2 浓度升高，以及顶端活性氧(reactive oxygen species，ros)过度产生等，会影响离子转运蛋白的驱动，导致微丝功能障碍、水解酶活化等。

5. 研究计划与进展

1.项目研究计划1)2016.3：准备植物材料，花柱s-rnase的分离、纯化及纯度检测、活性测定，外源s-rnase的配置2)2016.4：试验处理及花粉培养、花粉管线粒体纯化、生物特征检测，包括统计花粉管形态及数量、细胞骨架观察、观测花粉管生长情况、失活和死亡的时间、荧光标记、蛋白免疫印迹杂交检测花粉管线粒体及核dna情况3)2015.5：生物特征检测，包括膜电位测定技术测定花粉管内ca2 浓度、亚细胞定位测定花粉管尖端活性氧(ros)浓度，以及ros梯度消失引起花粉管生理代谢变化、花粉管顶端细胞壁成分红外光谱分析(ftir)。

4)2016.6：完成所有实验数据的整理与分析，项目总结和论文撰写。

2.预期研究成果1)了解梨自交不亲和性最新研究进展及实际应用前景。