通过RNA干扰（RNAi)增强植物黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)抗性的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）rna沉默现象最早是在对矮牵牛的花色研究中发现，napoli等（1990）将一个能够产生色素的基因转入矮牵牛中，发现植物中的同源基因和导入的基因出现了共抑制（cosuppression）现象，产生了白色的花。

之后，fire等（1998）在对秀丽新小杆线虫的研究中发现是由双链rna（double-str rna, dsrna）高效特异性地阻断了相应基因的表达，并针对这一现象提出了rna干扰（rna interference, rnai）的概念。

随后，这一现象在动物、植物、真菌中均有发现。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题研究目标 为给转基因砧木防控cgmmv提供理论支持，通过构建rnai载体转入烟草，已获得了抗cgmmv的转基因株。

通过比较不同转基因株系的抗性，获得可用于抵御cgmmv的最佳转基因片段。

研究内容a. 选择cgmmv基因组上不同的基因片段，将其正向和反向序列同时连入过表达载体，使其能转录形成hprna结构，并将构建完成的载体转化农杆菌。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案和可行性分析实验方案及研究方法a．rnai载体的构建将genebank上登录的cgmmv基因组序列进行比对分析，针对其中的两段复制酶基因、运动蛋白基因和衣壳蛋白基因的保守区域选择用于构建干扰载体的片段。

根据varsha wesley等人的方法（plant j, 2001, 27581-590），构建含有hprna结构的干扰载体。

具体方法是：对实验室保存的病毒分离物提取rna，通过rt-pcr方法扩增获得cgmmv基因组上复制酶、运动蛋白和衣壳蛋白上较保守区域的不同片段（长度在100-800 bp之间）共计12个；利用重组酶（peasy-uni seamless cloningassembly kit，全式金）将它们分别按正向和反向同时连入载体，正反片段中间插入拟南芥pdk基因的内含子（319 bp）相间隔；将构建好的载体转入e. coli dh5α感受态细胞，经测序验证载体的正确性后，提取质粒（axyprep质粒dna小量试剂盒，axygen）经过电转化转入农杆菌agrobacterium tumefaciens lba4404感受态细胞（takara）用于后续实验的侵染转化。

4. 研究创新点

RNAi是近20年来生命科学的研究热点，也是植物防御病毒感染的主要机制，利用该机制在烟草上筛选抗CGMMV的最佳转基因片段是一个有益的尝试，也是项目的主要特色。

5. 研究计划与进展

RNAi载体的构建农杆菌介导的葫芦遗传转化转基因植株的PCR、RT-PCR和Southern验证