葡萄叶片中自噬相关基因的克隆及表达分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义 植物生存过程中会遭遇各种环境因素的改变，这些外界因环境的改变破坏了植物细胞内ph、渗透压、活性氧代谢平衡等，使细胞器和胞内蛋白等物质遭受破坏，这些受损细胞器和蛋白的快速降解对于维持细胞稳态和植物生存具有至关重要的作用。

细胞自噬途径是植物最重要的蛋白降解途径之一，它既可以通过对细胞内功能异常的细胞器如功能受损的线粒体、过氧化物酶体等进行大批量的降解，参与植物对外界胁迫的响应过程，又可通过降解细胞内长寿命蛋白或者淀粉等营养物质参与植物种子萌发、花芽分化、果实成熟，叶片衰老等生长发育过程，是植物生命历程中不可缺少的生理现象。

葡萄(vitis vinifera l.)是世界上栽培最广的果树树种之一，其生长发育过程，例如花芽分化、果实成熟、叶片衰老等，以及其逆境响应机制等都离不开细胞自噬途径对胞内蛋白等物质的降解作用，因此研究葡萄中细胞自噬途径关键基因的功能对于深入了解葡萄自噬途径，认识葡萄生长发育以及对外界不良环境的响应机制都具有重要的意义。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标研究葡萄叶片中自噬相关基因的克隆及表达分析 研究内容（1）8个ATG基因的克隆及功能保守性分析（2）葡萄叶片衰老过程中叶绿素含量的测定 （3）葡萄叶片衰老过程中8个ATG基因的表达分析 （4）在病害、盐、水、黑暗胁迫条件下葡萄叶片中8个ATG基因的表达分析拟解决的关键问题1：ATG基因在葡萄中是否高度保守2：叶片衰老过程中随着叶绿素的降解，ATG基因表达是否上调3：逆境条件能否促使ATG基因表达量升高

3. 研究的方法与方案

研究方法测定葡萄叶片叶绿素（采用丙酮提取法） ;叶片总rna的提(参照sds-酚法） 进而判断葡萄叶片中自噬相关基因的克隆及表达分析技术路线 （1）葡萄叶片叶绿素含量的测定：采用丙酮提取法 （2）叶片总rna的提：参照sds-酚法（王壮伟 等，2004）（3）cdna第一链合成：参照takara公司提供的试剂盒按说明书进行） （4）基于本实验的前期研究成果，进行基因克隆与表达分析 实验方案及可行性分析本实验所用材料皆采自江苏省农博园3年生魏可（wink）葡萄。

叶片衰老过程：分别于新叶展开后10、30、50、70、90、110采样，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于-40℃备用。

病虫害：采摘感染葡萄霜霉病的病叶数片，清洗干净，迅速用液氮处理，于-40℃长期保存备用。

4. 研究创新点

特色或创新之处1 系统地研究了葡萄细胞自噬途径基因的时空表达特性2 研究了葡萄细胞自噬途径基因对外界环境的应答模式

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展2015.5~2015.10 样品处理2015.11~2016.2 叶片叶绿素含量测定，RNA提前，引物设计 2016.3~2016.4 实时荧光定量PCR分析，基因克隆2016.5 数据处理与分析与论文撰写