外源NO和H2O2诱导不同颜色洋葱花青素积累开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

花青素(anthocyanidin)是一种水溶性色素，可以随着细胞液的酸碱改变颜色，细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝。花青素是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色。花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播。常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层，部分果实以颜色深浅决定果实市场价格，在紫色蔬菜内也有。

除此以外，在自然状态下花青素常与各种单糖形成花色苷，因吸光性差异而表现出红、紫和蓝等色彩，其具有抗氧化、抗突变、抗增生等多种生理功能。no 作为植物抗逆胁迫和一些生理生化代谢的重要信号分子，在植物次生代谢启动、通过ros 反应参与植物抗性调控功能方面有重要作用。h2o2 是植物细胞应答逆境产生的重要信号分子，植物通过h2o2 过量产生调控一系列胁迫应答和次生代谢合成，大量研究表明，no 或h2o2 对植物遇到干旱、高温、低温、病害和盐碱等逆境时所产生的很多内源物质有调控作用。近年来研究表明，no 或h2o2 诱导植物次生代谢可以产生紫杉醇、葛根素、金丝桃素，而关于其在植物花色素代谢方面的研究很少。本试验采用snp、h2o2、snp h2o2 处理不同颜色的洋葱，研究其对洋葱花色素积累及相关酶类的调节，旨在探索no 和h2o2 诱导洋葱花色素合成反应及调节的机理，为鲜食保健洋葱品种的选育，洋葱花青素代谢与调控提供理论依据。

国内外关于花青素的研究有许多，关于花青素的合成，含量，影响因素等都有相关的研究与报道，但是关于洋葱中花青素含量的分析与研究还很少，所以此课题的研究具有一定的意义。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

（1）找出no和h2o2对洋葱花青素含量的影响

（2）不同时期花青素含量的不同

3. 研究的方法与方案

研究方法与实验方案：

（1） 种洋葱，在生科楼楼顶大棚中种植紫皮，黄皮，白皮洋葱，每种各两个32穴穴盘。

（2） 处理，现蕾期开始用清水、0.1 mmoll-1 snp（no 供体）、0.25 mmoll-1h2o2、0.1 mmoll-1 snp 0.25 mmoll-1 h2o2进行处理，每隔7 d 处理1 次，每处理5 株，3 次重复。取样时间按照各品种生育期依次进行。

4. 研究创新点

方法简便，结果直观，实验操作性强且重复性强，研究性强，实践与理论结合紧密。

5. 研究计划与进展

9月至4月：分别配制0.25 mmol/l h2o2，0.1mmol/l、0.2 mmol/l、0.3 mmol/l snp（no供体），以及0.1 mmol/l snp 0.25 mmol/l h2o2和清水六种试验试剂。将种子分成a,b,c三组，a组用0.25 mmol/l h2o2，0.1mmol/l、0.2 mmol/l、0.3 mmol/l snp（no供体）以及0.1 mmol/l snp 0.25 mmol/l h2o2试剂分别浸种，其余两组用清水浸种四小时。浸种后进行催芽，将b组种子置于含有0.25 mmol/l h2o2，0.1mmol/l、0.2 mmol/l、0.3 mmol/l snp（no供体），以及0.1 mmol/l snp 0.25 mmol/l h2o2试剂的棉布上分别催芽，其余两组则置于湿棉布上进行催芽二十四小时。催芽后，将三组种子栽于王建军老师的实验大棚。待鳞茎膨大时，c组用0.25 mmol/l h2o2，0.1mmol/l、0.2 mmol/l、0.3 mmol/l snp（no供体）以及0.1 mmol/l snp 0.25 mmol/l h2o2试剂分别处理，其余两组清水处理。

4月中旬：（1）花青素含量测定用ph示差法来测定洋葱花青素的含量。吸取1 ml提取液，加入ph 1.0的kcl缓冲液稀释至 25 ml，另吸取1 ml提取液，加入ph 4.5的乙酸钠缓冲液稀释至25 ml，分别在525 nm和700 nm下测定吸光值a。按公式计算含量：花青素含量（mg/l）[（a525-a700）ph 1.0-（a525-a700）ph 4.5]449.21 000]/26 900df，式中：449.2是矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；26 900摩尔吸光系数，df为稀释倍数。（2）苯丙氨酸裂解酶（pal）活性测定准确称取新鲜洋葱5g，并加入10ml含 5mmol / l巯基乙醇的硼酸缓冲液和0.5g的聚乙烯吡咯烷酮，用于防止其他颜色的干扰，并加入少量的石英砂在研钵中研磨呈浆状，均质过滤，滤液在4℃低温下10 000rpm离心15min，吸取上清液1ml后，加入1ml 的0.02mol / l苯丙氨酸和2 ml蒸馏水，总体积为4ml; 而对照品种不加其他底物，总共为上清液1 ml和蒸馏水3 ml，共计4ml。最后将提取液置于30℃恒温水浴0.5h，在290nm分光光度下测定其吸光值。（3）多酚氧化酶（ppo）活性测定 准确称取新鲜洋葱5g，加入5 ml 0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（ph 6.0），冰浴研磨后，放置4 ℃低温下 15 000 rpm离心 20 min。取上清液1ml与0.3ml的底物0.2mol/l邻苯二酚混合，在35 ℃下恒温水浴15 min后，加入0.1ml的ppo提取液，在410 nm下测定吸光值。（4）查尔酮异构酶（chi）活性测定 准确称取新鲜洋葱5g，加入5 ml 5mmol / l巯基乙醇缓冲液，其中3 ml 0.05 mol/l na2hpo4（ph 7.0）、0.5 ml 0.05 mol/l抗坏血酸、1.5 ml 0.018 mol/l巯基乙醇，冰浴匀浆，4 ℃下15 000 g 离心20 min，取1 ml上清液，加入1 ml 0.02 mol/l苯丙氨酸、2 ml 蒸馏水；对照为1 ml上清液加入3 ml蒸馏水。30 ℃恒温水浴0.5 h，在290 nm下测定吸光值[19-20]。测定花青素，苯丙氨酸裂解酶（pal）活性，多酚氧化酶（ppo）活性，查尔酮异构酶（chi）活性。

4月后旬：结果分析，试验数据采用spss 13.0 软件和excel 软件进行分析。