1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
梨为蔷薇科(rosaceae)，梨亚科(maloideae)，梨属植物。世界梨属植物约有60余种，分布于欧、亚、北美洲及南半球温带地区。我国目前梨属有18个种，其中原产我国的有13个种[1]，而且我国梨的生产总量、栽培面积和出口量均居世界首位[2]，其栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果，位居第三位［3］。由于高纤维，低卡路里且富含维他命和矿物质，梨是很受消费者欢迎的一种高营养水果。果实大小是商品梨的重要外观品质之一，近年来果品市场对商品梨果实平均单果重有了更高的要求。梨果实的大小与质量除了与授粉、套袋、肥水条件、生长调节剂等栽培管理因素相关外，遗传因素是决定梨果实重量的因素。梨果实大小与梨果实的内在品质密切相关，研究表明随着单果质量增大,果实可溶性总糖、可溶性固形物含量呈下降趋势，石细胞含量增加［4］，可滴定酸含量没有明显变化。因此，梨果实大小是决定梨果实品质的重要因素。梨果实大小性状是多基因控制的，研究控制梨果实大小的关键基因有利于从分子遗传水平改善梨果实品质，从而对梨产业发展产生积极地推动作用。
nac转录因子是植物特有的一类转录因子，在调控植物的生长发育，侧根发育、叶片衰老、应答生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用[5]。本研究旨在验证梨中的nac转录因子是否在果实生长发育过程中发挥重要作用，从而为梨果实的遗传改良提供基因资源。根据以往的研究报告，在梨果实的发育过程中nac基因pynac有可能参与了果实发育的过程，推断pynac在果实发育过程中的表达情况与果实的纵径、横径及单果重形状的变化特征存在着一定联系，特别是纵径和横径，在相关性分析中，它们的变化趋势和pynac的表达情况比较相符，相关系数也更大[6]。pynac属于与细胞分裂相关的nam亚组，而细胞分裂在植物生长发育过程中的各个方面都起着关键作用，因此推测pynac有可能调控果实发育中的细胞分裂，影响果实的纵径和横径，从而影响果实的最终大小。
在此理论基础上，再进一步对梨pynac基因这一功能进行验证和进一步探索，而转基因技术是探究基因功能的有效方法［4］。转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学，基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的dna片段。dna片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工筛选，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状，从而能对某一基因的功能进行具体的验证和探索。本试验采用农杆菌介导转化这一普遍适用且转化效率较高的植物转基因的操作方法，农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有ti质粒和ri质粒，其上有一段t-dna，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将t-dna插入到植物基因组中。因此，人们将目的基因插入经过改造的t-dna区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合［7］，然后通过组织培养技术，再生出转基因植株。利用已有的农杆菌构建的表达载体pcambia1301-pynac，感染模式植物micro-tom番茄的受伤部位，并诱导产生不定芽［8］，并做进步筛选和培育，观察并分析统计t1代选育植株的果实的纵径和横径，验证pynac基因是否与果实大小相关，也为进一步探究梨pynac基因的功能打下基础。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究目标
本研究将过量基因表达载体pcambia1301-pynac，使用农杆菌介导的遗传转化方法转化模式植物micro-tom番茄，成功转化并得到再生植物，通过与野生micro-tom番茄的性状进行观察、对比，以验证梨的pynac基因（基因id号为pbr024863.1）功能是否与梨果实的纵径、横径及果实大小有关。
3. 研究的方法与方案
一、研究方法
1、用70%乙醇处理Micro-Tom番茄种子30 s，然后用无菌水洗涤3遍，再用2.5%次氯酸钠处理5 min，最后用无菌水洗涤4遍，用镊子夹取种子置于M1萌发培养基上，生长在25℃的条件下，光周期为16h与8h黑暗相互交替，获得无菌组培苗。
2、经过14d左右的生长，Micro-Tom番茄子叶完全展开第一片真叶露心时，取超低温冰箱中保存的表达载体pCAMBIA1301-pyNAC，于超净工作台在含有50 mgL-1Kan和100 mgL-1Rif的固体LB平板上划线，获得单菌落
3、用接种环蘸取单克隆，在含有50 mgL-1Kan和100 mgL-1Rif的固体LB平板上划井字线，28℃培养36h左右，收集菌体。
4、切下子叶，垂直于主脉横切12刀，置于M2预培养培养基上，正面朝上，盖一张小滤纸，黑暗培养1天。
5、用手术刀刮取收集菌体于M3悬浮培养基里28℃、100 rpm悬浮培养，一定时间后测定其OD值，0.3-0.8范围可做侵染。取预培养的子叶，将OD值适宜的菌液导入盛有子叶的三角瓶，浸泡侵染8-10 min，期间不断振荡。
6、将侵染后的子叶置于无菌滤纸上吸附子叶表面的大滴菌液，然后接种于M4共培养培养基上，正面朝上，再盖一张小滤纸，暗培养2 d。
7、共培养2 d后，用含有400 mgL-1头孢的无菌水洗一遍，然后用无菌水洗3-5遍，最后置于M5筛选培养培养基A上，组培室培养15 d左右。
8、待子叶分化出的不定芽有明显伸长的节间，将其切下并扦插于M6筛选培养基B中进一步筛选培养。
9、提取转化苗DNA通过利用特定引物进行PCR验证进一步筛选，获得转基因成功的阳性番茄苗。
10、将阳性苗置于M7生根培养基上进行生根诱导。之后进行移栽，为T0代番茄植物，待植物长成收集其种子。将种子继续播种获得T1代番茄植物，并栽培普通Micro-Tom番茄，待植物长成果实发育成熟，将T1代番茄植株与普通番茄植物的果实进行形状对比及观察统计分析，验证梨pyNAC基因是否与果实大小相关。
二、技术路线
Micro-Tom番茄组培苗的继代培养和获取
农杆菌介导法将基因导入番茄组
转基因番茄阳性苗的筛选和T0代株系培养
T1代再生株系的生根和移栽和野生Micro-Tom番茄的生根和移栽
后期同等条件下对两种番茄进行培育，获得完整番茄果实
采集果实，对比观察性状，分析数据
三、实验方案
1、植物材料 Micro-Tom番茄种子购自南京丰硕园艺有限公司
2、载体 质粒pCAMBIA1301，为本实验所使用的表达载体
3、番茄遗传转化体系所用培养基配方
培养基名称 | 代号 | 培养基成分 |
萌发培养基 | M1 | 1/2MS 30 gL-1蔗糖 7.5 gL-1琼脂粉（pH=5.8） |
预培养培养基 | M2 | MS 30 gL-1蔗糖 9 gL-1琼脂粉 2.0 mgL-1玉米素（pH=5.8） |
悬浮培养基 | M3 | MS 30 gL-1蔗糖 100 mgL-1 AS（pH=5.8） |
共培养培养基（即暗培养） | M4 | MS 30 gL-1蔗糖 9 gL-1琼脂粉 2.0 mgL-1玉米素 100 mgL-1 AS（pH=5.8） |
筛选培养基A | M5 | MS 30 gL-1蔗糖 9 gL-1琼脂粉 2.0 mgL-1 玉米素 400 mgL-1 头孢（pH=5.8） |
筛选培养基B | M6 | MS 30 gL-1蔗糖 9 gL-1琼脂粉 0.2 mgL-1 玉米素 400 mgL-1 头孢（pH=5.8） |
生根培养基 | M7 | 1/2MS 30 gL-1蔗糖 7.5 gL-1琼脂粉 2.0 mgL-1IBA 200 mgL-1 头孢（pH=5.8） |
四、可行性分析
本研究是为探究梨果实大小的影响因素而提出的，是所在课题组多年来一直从事梨的研究探索和果树分子遗传方面研究的基础上形成的。试验研究将在本实验室开展，试验材料由南京农业大学园艺学院试验基地提供。试验过程将在南京本地进行，本研究多数为室内试验，不受季节等因素的影响，可利用课余时间，暑假期间进行试验分析，避免与学习时间冲突。
申请人利用课余时间丰富积累了大量相关知识，并在申请前与实验室研究生的带领下开展了部分预备实验，进行了实验操作和练习，具有较高的试验操作水平，另外还具备较强的问题分析能力。
指导老师吴俊教授所在实验室为果树分子生物学实验室，长期从事梨方面的研究工作，承担多项国家及省部级项目，具有良好的研究基础，实验设备齐全，研究条件良好，这些均为本项目的顺利完成提供了技术和人力的保障。
4. 研究创新点
1、梨果实大小形状是多基因控制的，研究验证控制梨果实大小的关键基因，在分子和遗传水平筛选梨果实大小形状的遗传改良，对于梨产业发展将产生积极的推动作用。
2、在研究过程中多次试验测试，分别获取模式植物继代、生根、再生培养基的合理高效的激素配比。
5. 研究计划与进展
2015.9 micro-tom番茄组培苗的培养
2015.10 利用农杆菌介导法将基因导入番茄组织
2015.112015.12 转基因番茄阳性苗的培养基筛选和pcr验证
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