1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
（一）本课题的意义： 随着工农业的快速发展，大量重金属污染物通过各种途径进入自然界的土壤、水体和大气中，工业三废的大量排放、矿山的大量开采和金属冶炼、化肥和农药的滥用、城市生活垃圾的大量产生、污水和污泥直接用于农业生产等原因，土壤及水体中重金属污染日益严重[1]。 据统计资料显示[2]，1980 年全国受三废污染的农田面积为 267 万 hm2，1988 年为670 万hm2，1998 年已经达到 2000 万 hm2，约占耕地总面积的 1/5，造成经济损失 200 亿元。这表明重金属污染已经产生了严重的后果，并因为重金属污染不易消除等特点，其危害会长期存在，并在动植物体内累积，影响动植物的健康，最终影响人类生命健康。 针对此现象很多学者致力于研究如何更彻底更低耗的解决或缓解重金属污染。目前研究出用大型水生植物修复重金属污染技术最为简单高效。荷花属于莲科莲属多年生挺水草本植物, 又名莲或莲花, 是我国十大名花中唯一的水生花卉,其作为一种大型的水生植物，对重金属有一定的吸附能力，具备修复重金属污染水体的潜能，因此深入研究荷花修复重金属污染的机理至关重要。 有实验表明，植物在对抗重金属污染的逆境时会产生应激产物乙烯及葡萄糖，据此结果可推测葡萄糖与乙烯对植物抗重金属污染具有一定的作用。且有相关实验表明葡萄糖与乙烯互作会对植物产生影响，因此，本实验将研究在葡萄糖与乙烯的交叉处理下对荷花响应Cd胁迫的影响，为日后深入研究荷花修复重金属污染奠定一定理论基础。
（二）国内外研究情况： 镉是一种植物生长的非必需重金属元素，但研究表明[3]镉对一些植物生长存在剂量效应，在一定浓度范围内，镉能促进植物的生长。虽然低浓度的镉有促进植物生长的作用，但高浓度的镉却会对植物产生抑制生长的作用[4]，实验表明[5]，在高浓度镉存在情况下，植物首先表现出叶、茎黄化，叶片脱落，且植物的株高、叶长、叶宽、茎粗、干质量等生物量随着 Cd 浓度的升高而明显的下降。若 Cd 的存在浓度过高，植物则停止生长甚至出现失水枯萎的现象。但对于抑制生长的具体元素目前仍没有详尽的论述。 乙烯是一种气态激素，其对植物生长具有极大重要性。目前研究发现乙烯通过信号网参与调控了植物的生长和发育过程。在正常生长情况下，乙烯的存在会抑制植物根莲叶的生长并且延迟开花，然而在生物或非生物胁迫下乙烯信号则对植物维持正常的生长生存有着重要的意义[6]。乙烯已经被证明在盐、干旱及臭氧等非生物胁迫下对植物启动应答机制方面有重要的作用[7]。 Arteca和Arceta研究发现重金属胁迫将会快速的诱导乙烯的产生，也就是说明乙烯的产生参与了植物对重金属的反应体制[8]。对此有许多文献做出辅证，如夏红霞等[9]的试 |
验结果表明，鱼腥草对铬具有一定的富集能力，喷施乙烯利有利于鱼腥草对铬的富集。喷施乙烯利可提高鱼腥草叶片的 POD，SOD，CAT活性，促进植物叶绿素的合成，增强植物光合作用和新陈代谢以及鱼腥草的抗逆性，减少重金属铬对鱼腥草的伤害，并可增加鱼腥草对铬的富集能力。陈丹丹[10]在实验中发现ACS2、ACO2、ERS1及EIN3四种基因的表达在镉胁迫下表现出一定的增强，而当用氯化镉处理时几种乙烯信号的表达量相对于其他几个浓度的表达量明显增强，乙烯相关基因在镉处理下表达的增加说明了乙烯参与了拟南芥镉胁迫的过程。这些都证明了乙烯对植物抗重金属胁迫有一定的帮助，乙烯有助于植物在环境胁迫下的生长适应。 除此之外，葡萄糖对植物抗逆性也有很大的帮助。许多文献都表明，在逆境胁迫下葡萄糖对植物有缓解胁迫的作用。邱宇婷等[11]通过研究镉胁迫下萝卜幼苗内硫代葡萄糖苷的含量变化，发现在逆境胁迫下，植物体内葡萄糖的含量明显上升，因此可推断，葡萄糖对植物抗逆境性起到一定的作用。朱巧巧等[12]在不同浓度葡萄糖对铅胁迫下小球藻部分生理特性的影响实验中验证出不同浓度的葡萄糖使小球藻细胞内光合色素含量呈先升后降的趋势。实验组小球藻可溶性蛋白质和可溶性糖的单位质量含量都低于对照组,并且随着葡萄糖浓度的升高而降低；但其单位体积含量却都高于对照组。说明适宜浓度的葡萄糖对铅胁迫下小球藻的生长有一定的影响。 除重金属胁迫之外，在别的逆境胁迫下，葡萄糖同样有十分显著的影响。例如,Zhou等发现,与乙烯信号相关的高水平外源葡萄糖可以延迟拟南芥种子萌发和抑制幼苗生长,而低浓度的外源葡萄糖、蔗糖和果糖可以解除ABA引起的对拟南芥种子萌发和幼苗生长的抑制效应,并与HXK和ABA信号途径有关[13-14],这提示不同浓度糖分子的不同生理效应可能同植物的具体发育状态有关,并可能具有不同的信号通路。 综上所述，葡萄糖对植物响应包括重金属胁迫在内的非生物胁迫有重要的积极作用。 近期有相关实验指出，在研究糖信号时，对拟南芥中筛选出的糖不敏感及糖超敏感突变体进行表型及分子遗传学分析，发现一些糖反应突变体表现出植物激素合成突变体或信号突变体的性状特征，从而揭示了糖与植物激素之间存在广泛而密切的相互作用[15]。对此，深入研究发现，乙烯与葡萄糖存在一定的互作影响，葡萄糖在乙烯信息转导中起到了一定的作用，二者可以同时在植物对抗逆境胁迫中起到一定的作用，对此也有相关的报道。葡萄糖调节乙烯是通过对乙烯生物合成基因以及乙烯不敏感基因的调控实现的[16]。葡萄糖可以抑制乙烯氧化酶的活性并且通过此来影响果实的成熟[17]。不仅如此，葡萄糖还能通过抑制鲜切花体内的乙烯含量从而达到延缓鲜花衰老抑制花茎的作用[18]。前人的研究资料虽丰富，却鲜少有乙烯与葡萄糖互作对植物响应重金属胁迫的影响的文献资料。因此研究葡萄糖与乙烯的互作作用有极大的意义。 在实验对象方面，大部分研究学者都把目光放在了模式植物上，对水生植物的研究却很少，但据文献表明，大型水生植物对水体中重金属污染有一定的修复作用。大型水生植 |
物在水污染治理中可以发挥多种作用，通过自身的生长代谢可以大量吸收氮、磷等水体中的营养物质, 而其中一些种类还可以富集不同类型的重金属或吸收降解某些有机污染物；通过促进微生物的生长代谢，可以使水中大部分可生物降解有机物(BOD)降解；通过抑制低等藻类的生长，控制富营养化的表现形式等[19]。因此具体研究葡萄糖与乙烯互作对水生植物响应重金属胁迫的影响对日后更好的提高水生植物修复重金属污染技术是至关重要的。 综上，本实验将以荷花为试材，通过研究乙烯与葡萄糖的交叉互作作用，分析其二者对大型挺水植物荷花抗重金属Cd胁迫的机理，为以后的研究提供数据基础和理论依据。 参考文献： [1] 孔德政,裴康康,李永华,张曼. 铅、镉和锌胁迫对荷花生理生化的影响[J]. 河南农业大学学报,2010,(04)402-407. [2] 刘艳菊. 外源镉及乙烯对拟南芥幼苗生理代谢的影响研究[D].东北林业大学,2013. [3] 蒋汉明,李书启,韩希凤,王华,郭剑霞. 镉对植物生长的影响及植物耐镉机理研究进展[J]. 广东微量元素科学,2012,(05)1-6. [4] 陈伟. 重金属胁迫对草坪草生长发育及生理特性的影响[D].甘肃农业大学,2014. [5] 谢惠玲，陈爱萍，张凤英，等．紫苏对不同浓度镉胁爱的影响［J］．中国生态农业学报，2011，19 (3)672 -675． [6] Pierik R, Tholen D, Poter H, et al. The Janus face of ethylene growth inhibitionstimulation.[J]. Trends in Plant Science, 2006, 11(4)176-83. [7] Ad P, Cheng H, De G L, et al. Integration of plant responses to environmentally activated phytohmonal signals.[J]. Science, 2006, 311(5757)91-4. [8] Cao W H, Liu J, He X J, et al. Modulation of ethylene responses affects plant salt-stress responses.[J]. Plant Physiology, 2007, 143(2)707-19. [9] 夏红霞,朱启红.乙烯利对铬胁迫下鱼腥草的影响[J]. 山西农业科学,2010,(12)23-26. [10] 陈丹丹. 乙烯调节镉胁迫下拟南芥根构型的研究[D]. 东北林业大学, 2014 [11] 邱宇婷,蒋岚,朱毅等. 镉胁迫下萝卜幼苗的硫代葡萄糖苷含量变化研究[J]. 安徽农业科学,2012,(06)3490-3493. [12] 葸玉琴,崇梅,董杰等. 不同浓度葡萄糖对铅胁迫下小球藻部分生理特性的影响[J]. 环境工程学报,2016,(05)2742-2746. [13] Zhou L, Jang J C, Jones T L, et al. Glucoseethylene signal transduction crosstalk revealed by an Arabidop.si.s glucose-insensitive mutant[J] .Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95 10294一10299. [14] Finkelstein R R, Lynch T J .Abscisic acid inhibition of radicle emergence but not seedling growth is suppressed[J] .Plant Physiol, 2000, 122 1179一1186. [15] 王彦杰. 葡萄糖对牡丹切花采后乙烯生物合成及信号转导的影响[D].北京林业大学,2013. [16] Hong J H, Cowan A K, Lee S K. Glucose Inhibits ACC Oxidase ActivityEthylene Biosynthesis in Ripening Tomato Fruit[J]. Plant Growth Regulation, 2004, 43(1)81-87. [17] Andriunas F A, Zhang H, Weber H, et al. Glucoseethylene signalling pathways converge to regulate trans-differentiation of epidermal transfer cells in Vicia narbonensis cotyledons.[J]. Plant Journal, 2011, 68(6)987998. [18] Wang Y, Zhang C, Wang X, et al. Involvement of glucose in the regulation of ethylene biosynthesissensitivity in cut Paeonia suffruticosa, flowers[J]. Scientia Hticulturae, 2014, 169(169)44-50. [19] 种云霄, 胡洪营. 大型水生植物在水污染治理中的应用研究进展[J]. 环境工程学报, 2003, 4(2)36-40. |
2. 研究的基本内容和问题
（一）研究内容： 1.实验材料的选取 本实验选取大小相近的若干粒荷花种子放置在培养箱中培养，选取生长到10-15cm的荷花幼苗。 2.实验材料的处理 将荷花幼苗分置于氯化铬溶液，葡萄糖溶液，乙烯前体ACC溶液等不同处理之中，在变温培养箱中培养48小时，取出，取样，冷冻。 3.生长指标的测定 将刚取出的荷花幼苗放置在平面上，比较不同处理之间的外观长短，测量长度。 4.生理指标的测定 将取好的样用不同方法测定其电导率，MDA,SOD,POD,CAT,GR,APX,ASA,GSH等生理活性指标。 5.实验数据分析 将测定好的数据用excel软件分析差异性等。 （二）研究目标： 本实验目标为研究高浓度Cd胁迫对荷花幼苗生长影响，加入外源乙烯ACC及葡萄糖对Cd胁迫的影响，以及葡萄糖与乙烯互作对Cd胁迫产生何种影响。 （三）拟解决关键问题： 探究Cd胁迫因何对荷花幼苗生长产生影响，若葡萄糖对Cd胁迫产生作用则与什么物质反应以达到其目的，目前所知，葡萄糖在植物体内信号传导的作用，则葡萄糖缓解Cd胁迫时是否与信号转导作用有关。 |
3. 研究的方法与方案
（一）研究方法： 选取最适浓度组选取若干粒（≥50）大小相近的荷花种子用蒸馏水在25℃-28℃培养箱中培养5-7天，直到荷花幼苗长度达到10-15cm时取出。选取长度基本相同的7组荷花幼苗分别放置在300ml蒸馏水，将150μL氯化铬溶液加入到300ml蒸馏水中制成新的Cd处理溶液（以下Cd处理溶液均为此浓度），以及将150μL氯化铬溶液及60ml不同浓度葡萄糖溶液（浓度分别为100mM,50mM,30mM,20mM,10mM）加入到300ml蒸馏水中，放置在光照时长10h，温度28℃；黑暗时长14h，温度25℃的变温培养箱中培养48小时，取出，逐一放置在白纸上，对比不同处理间的长度变化，选取相较于蒸馏水及Cd处理最适合荷花幼苗生长的葡萄糖浓度，作为日后研究时葡萄糖的标准浓度。 处理：选取若干粒（≥100）大小相近的荷花种子用上述相同方式培养若干天，选取10-15cm长度基本相同的9组荷花幼苗分别放置在蒸馏水，Cd处理溶液，含有Cd处理的100mM葡萄糖溶液、100mM甘露醇溶液、100mM葡萄糖溶液和20.22g/L乙烯前体ACC溶液、100mM甘露醇溶液和20.22g/L ACC溶液、只含有20.22g/L的ACC溶液、只含有3ml的乙烯抑制剂STS溶液以及含有20.22g/L的ACC溶液和3mlSTS溶液这9种不同处理之中，按上述方法放置在变温培养箱中培养48小时，其中含有葡萄糖及甘露醇溶液的ACC溶液为开始培养后6小时再加入，其余则初始加入培养。48小时后取出，放置在白纸上比较不同处理间的生长指标差异，记录长度。 取样：将不同处理的荷花幼苗的茎部剪成1cm左右的小段，用卫生纸吸干水分，每称取0.2g样品放置在一张锡箔纸内包裹起来，标注处理，并迅速放进液氮内，使其迅速冷冻，放置实验室用冰箱内保存以便日后测量生理指标。 测量电导率：称取0.2g样品放入含有30ml蒸馏水的锥形试管内，放置在摇床上摇24小时，用电导率测定器测定电导率，再次摇24小时后再测定电导率，将两次数据输入excel作具体分析。 测量MDA：称取0.2g样品，剪碎，加入5mL5 TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，转入5mL离心管在3000r/min下离心10min。吸取上清液2ml用MDA-TBA法测定在532nm、600nm和450nm处的吸光度值。将数据输入excel根据公式作具体分析。 |
测量抗氧化酶活性：称取0.2g样品洗净后置于研钵中，用液氮磨样，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为5种酶活的粗提液。用遮光对比法测定SOD；用H2O2-愈创木酚法测定POD；用过氧化氢酶分解H2O2法测定CAT；用AsA-POD法测定APX；用NADPH-GSSG法测定GR。 测量抗氧化剂活性：称取0.2 g样品，将样品用2 ml 5％TCA充分研磨，在15000g离心10 min，取上清液定容至2 ml。根据AsA可将铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与二联吡啶反应生成红色螯合物，在525 nm处的光吸收波长与AsA的含量成正比的原理测定AsA含量；根据GSH可以将DHA还原成AsA的原理利用DTNB测定GSH的含量。 |
（二）技术路线：
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（三）可行性分析： 本实验选取的荷花种子来源广泛，价钱便宜，培养方便，因只培养到荷花长出短茎只需培养在保温箱中即可，因此即使冬天也可进行实验，时间无需过多注意。 实验中试剂及材料实验室大多都具备，个别试剂可通过一般调制配制得到。 荷花虽然研究者较少但关于重金属对植物影响有许多文献可通过中国知网等途径获取，有一定的理论基础。 |
4. 研究创新点
本项目创新之处： 重金属对荷花的影响研究者较少，本课题对此进行一个略深入的研究，并且对重金属Cd对荷花影响的因素通过对比实验做出一定分析。本实验就乙烯和葡萄糖对于Cd胁迫影响分别做出对比实验进行分析，并就葡萄糖和乙烯互作对于Cd胁迫影响做出实验分析。且对葡萄糖的信号分子部分做出一个对比排除实验。 |
5. 研究计划与进展
本实验预期计划： 本实验预计从2016.5开始到2017.4结束 2016.5 开始进行实验，破壳种苗开始逐批养育荷花种子 2016.6 对荷花幼苗进行不同处理，培育并取样，初步测定电导率数值，进行数据分析，比较不同处理对幼苗的细胞膜伤害程度，得出初步的葡萄糖及乙烯对响应Cd胁迫影响的结论。 2016.8 对取好的荷花幼苗样品进行MDA的测定，通过MDA数据比较出不同处理下荷花幼苗的膜脂过氧化程度。 2016.10对取好的荷花幼苗样品进行SOD,POD,CAT,AX,GR这5种过氧化酶的测定，结合MDA的数据进行综合分析。 2016.11 对取好的荷花幼苗样品进行抗氧化剂AsA,GSH的测定，结合上述生理指标进行综合分析。 2016.12-2017.4进行数据补测，重复实验，整理数据，进行毕业论文的撰写。
预期研究成果： 通过测定各处理下荷花的生理活性并与对照组作对比，利用excel进行图表分析、方差分析以及差异显著性分析等，探究乙烯与葡萄糖在Cd胁迫下对荷花的影响以及乙烯与葡萄糖互作对Cd胁迫的影响。为包括Cd在内的重金属治理提供理论依据，为更深层次的实验提供数据基础。 |
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