赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆、序列分析与时空表达特征鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

葡萄（vitis vinifera l.）是世界上广泛种植，用于鲜食、酿酒、制汁和制干，具有重要经济价值的水果。在市场上很受欢迎，目前在世界上的栽培面积仅次于柑橘。白罗莎里奥属欧亚种，2003年3月从日本引入我国，表现出粒大、外观靓丽、口味纯甜爽脆、丰 产、耐贮运、抗逆性强等优良性状，是一种有核品种。无核是鲜食和制干葡萄的优良性状之一^[1]，无核葡萄具有较高的商业价值，在国内和国际市场上占据重要地位，具有良好的市场前景，颇受葡萄加工产业的欢迎和广大消费者的青睐，也给生产者和加工者带来了巨大的经济效益。目前，生产上培育无核葡萄有两种主要途径：一是，直接培育或引进无核品种；二是，人工诱导产生无核果^[2]。但是，因我国无核葡萄品种比例较小，育种进程又较慢，无核葡萄的生产远远不能满足市场的需求，而从国外引进的无核品种适应性较差；这使得有核品种的无核化成为生产上培育无核葡萄的主要途径。生产上主要通过外源赤霉素来诱导葡萄无核化。无核主要是由赤霉素诱导葡萄单性结实或假单性结实引起的。单性结实是不经过受精作用而直接发育形成果实；假单性结实是葡萄经过正常的授粉受精后，其合子胚在发育过程中由于某些因素的影响而终止发育，形成胚败育。

目前随着国内外用赤霉素处理葡萄使其无核的研究越来越多。证实赤霉素对葡萄胚珠败育存在影响。并且不仅仅只在葡萄上，在其他植物上也已经证明，施用赤霉素可以控制花粉和胚珠的生长发育。但目前为止赤霉素诱导葡萄胚败育的分子机制尚不清楚。阐明赤霉素诱导葡萄胚败育的分子机制、发掘赤霉素诱导葡萄胚败育的相关基因对于开展无核葡萄分子设计育种具有重要意义。因此，开展赤霉素诱导葡萄胚败育的相关基因的分析研究非常必要。

目前，赤霉素诱导葡萄胚败育的生理机制方面研究相对较多，而其分子机制方面报道颇少。近期研究发现，mads-box基因在植物胚珠、果实发育和成熟过程中起着重要的作用。^[3]lec基因对调控赤霉素和脱落酸的动态平衡来诱导和维持胚的成熟，阻止胚的萌发有重要的影响^[4]。基于此，该课题将以mads-box基因和lec基因为切入点，选择agl15、agl23、lec1、lec2进行研究。探索赤霉素诱导葡萄胚败育过程中agl15、agl23、lec1、lec2 时空表达机制并作出初步阐释。本研究将有助于拓宽对赤霉素诱导葡萄无核化的机制的认识，丰富葡萄无核化的理论，为有效开展无核葡萄的设计育种以及探索更安全的生产无核葡萄的新方法提供理论依据；同时，也有助于更科学地指导葡萄无核化生产。因此，本研究具有重要的理论与生产意义。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本项目拟通过花后赤霉素处理研究赤霉素诱导白罗莎葡萄胚败育的分子机理。

①完成响应赤霉素诱导葡萄胚败育过程的相关基因agl15、agl23、lec1、lec2克隆；

②鉴定基因agl15、agl23、lec1、lec2在葡萄胚败育过程中的时空表达图谱，以及表达水平之间的相关性；

3. 研究的方法与方案

研究方法：通过ctab法对赤霉素处理后各时期白罗莎葡萄提取各组织总rna，并反转录构建cdna文库；利用qrt-pcr分析agl15、agl23、lec1、lec2基因的时空表达图谱；利用电子显微镜观察胚胎的形态结构结构；通过蒽酮比色法等方法测定可溶性糖、可溶性蛋白、内源激素、多胺等物质的含量。

实验方案：

⑴ qrt-pcr技术分析目的基因的时空表达

4. 研究创新点

（1）无核葡萄在鲜食与制干葡萄产业中占据着重要位置，但因无核葡萄品种较少，生产上主要采用赤霉素诱导葡萄单性结实生产无核果，而胚败育是是葡萄单性结实的一种重要形式，目前为止其分子机制尚不清楚。因此，很有必要开展相关机理研究。

（2）MADs-Box基因和LEC基因在植物胚珠、果实发育和成熟过程中起着重要的作用。^[4]基于此，该课题将以MADs-Box基因和LEC基因为切入点，探索赤霉素诱导葡萄胚败育过程中AGL15、AGL23、LEC1、LEC2基因表达机制并作出初步阐释。本研究将有助于拓宽对赤霉素诱导葡萄无核化的机制的认识，丰富葡萄无核化的理论，为有效开展无核葡萄的设计育种以及探索更安全的生产无核葡萄的新方法提供理论依据。

5. 研究计划与进展

第一阶段：2016.5-2016.9

(1) 葡萄实验材料选择与处理。

(2) 赤霉素处理、多效唑处理与对照处理的的葡萄组织细胞形态结构观察与生理特性鉴定。