月季中AOS、COI1的基因克隆及功能验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、研究意义月季，蔷薇科蔷薇属的直立灌木，因其花艳丽丰富、香气浓郁、四季常开，是鲜切花中深受人们喜爱的一个品种，适用于美化庭院装点园林，更是四大切花之首，有花中皇后的美称。

随着近年来人们在春节情人节等节日对月季鲜切花的需求量节节攀升，并且对于家庭园艺的需求越来越大，月季生产中如何提高其产量与质量的问题尤为重要。

茉莉酸及其挥发性甲酯衍生物茉莉酸甲酯和氨基酸衍生物统称为茉莉酸类物质，也称为茉莉素、茉莉酮酸和茉莉酮酯, 是植物体内起整体性调控作用的植物生长调节物质。

2. 研究的基本内容和问题

1、 研究目标本实验从茉莉酸途径入手，选取茉莉酸合成途径的aos基因，以及茉莉酸信号转导途径中coi1基因进行研究，通过在拟南芥突变体中转入基因的过表达载体与野生型拟南芥进行表行对比，验证月季中这两个关键基因在茉莉酸途径中的功能。

2、 研究内容（1） 月月粉中aos、coi1基因的克隆、测序，以及过量表达载体的构建；（2） 过量表达aos和coi1，转基因至拟南芥的缺失突变体中，从而验证月季中的这两个基因与拟南芥中这两个基因的功能是否相同；（3） 综合以上研究结果，验证月季中aos和coi1的功能。

3、 拟解决关键问题目前月季中的aos和coi1基因在茉莉酸途径中的功能还没有得到验证，本实验通过在拟南芥aos和coi1突变体中转入过表达载体的aos和coi1基因，与野生型拟南芥进行根的长度对比，可以证实月季中aos和coi1基因的作用与拟南芥中aos和coi1的作用一致，即在茉莉酸的合成和信号转导途径中发挥重要作用，从而对植物的生长发育以及抗性等方面发挥重要作用。

3. 研究的方法与方案

1、技术路线1.1 组织培养月月粉：（1） 剪取月月粉枝条，将枝条剪成带1-2腋芽的小段；（2） 流水冲洗过夜；（3） 酒精洗10秒，升汞洗10min，无菌水洗一遍，接种于初代培养基上；（4） 等待长出腋芽之后，剪取接种于增殖培养基上，继代繁殖；（5） 培养无菌植株；（6） 使用月月粉叶片提取cdna。

1.2 野生型和突变体的拟南芥种植：（1） 配置1/2ms培养基，倒平板；（2） 种子用naclo进行消毒、洗涤；（3） 将拟南芥种子点样至培养皿中，间距2cm；（4） 封闭培养基，4度下春化2-3天；（5） 将培养皿移到培养室中继续生长；（6） 待到4片真叶长出时，将幼苗移植入土壤混合物；（7） 待植株生长成熟后收获种子，脱粒、清洁、干燥。

1.3 分子实验： （1） 提取月月粉中的rna,反转录cdna；（2） aos、coi1基因的克隆；（3） 连接转化：将目的基因连接到d-topo载体，转大肠杆菌trans-t1，涂氨苄板，37度培养箱培养16小时，挑菌，菌液pcr检测； （4） 送测，测出dna序列，选出正确的菌株；（5） 双酶切：选出正确的菌株提取质粒，双酶切目的基因与1a，进行t4连接；（6） 转化：连接产物转入大肠杆菌，涂板，37度培养箱培养12小时，挑菌，菌液pcr，检测并提取质粒；（7） lr反应：用1a-aos与载体r05（过量表达）连接，1a-coi1与r05（过量表达），并转入农杆菌；（8） 表达载体构建：选阳性克隆菌转入农杆菌gv3101，涂板，28度培养48小时，挑菌，prc检测；（9） 农杆菌侵染转化至拟南芥，收获种子筛选出转基因种子；（10） 转基因幼苗与野生型幼苗做表型对比，验证aos和coi1的作用。

4. 研究创新点

拟南芥中AOS和COI1基因的功能已经得到验证，然而月季中的AOS和COI1基因还未被测序，功能还未被验证，未能证实其与茉莉酸途径的关系。

本实验从月季中AOS和COI1基因的功能入手，验证其功能。

5. 研究计划与进展

2016／9－2017／2 完成月月粉无菌体系的建立； 2017/3－2017／7 克隆基因，完成表达载体构建；2017/9－2018/1 种植野生型以及AOS COI1突变体拟南芥；2018/1－2018/4 将过量表达的载体转化至拟南芥植株；2018/4-2018/5 分析实验结果、撰写实验论文