葡萄SBP-box18基因的克隆及其在葡萄果实发育成熟过程中的作用分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）1.1研究意义果实发育与成熟是植物生长发育的重要阶段，是果实品质形成与调控的生物学基础，对其进行研究具有十分重要的理论与实践意义。

果实成熟调控是果树生产的核心问题。

目前，众多研究表明，mads-box（mcm1、agamous、deficiens、srf4）和spb-box（squamosa promoter-binding protein）转录因子在植物生长发育过程起着重要调控作用，尤其是在花发育中起着关键作用。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标（1）葡萄果皮愈伤组织培养体系的建立；（2）用mads-box1和spb-box18侵染葡萄果皮愈伤组织以及在番茄上进行瞬时表达，观察对照转基因体系与野生体系葡萄果皮愈伤组织和番茄果实颜色的变化；（3）阐释mads-box1和spb-box18基因在葡萄果实着色成熟中的调控作用。

2.2研究内容（1）以巨峰葡萄皮为原始材料，经组织培养使其形成愈伤组织；（2）组织培养培育出番茄苗；（3）克隆mads-box1和spb-box18两个基因；（4）构建载体，连接转化；（5）对愈伤组织进行侵染；（6）在番茄上进行瞬时表达；（7）对比分析转基因体系与野生体系葡萄果皮愈伤组织和番茄果实颜色的变化，初步阐释mads-box1和spb-box18基因在葡萄果实着色成熟中的调控作用。

2.3拟解决的关键问题（1）克隆基因并构建载体，利用农杆菌介导法转入葡萄果皮愈伤组织；（2）构建葡萄果皮愈伤组织培养体系；（3）分析转基因体系中mads-box1和spb-box18的表达造成的与野生体系的差异

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法（1）葡萄果皮愈伤组织的诱导：基本培养基b5培养基3.21g/l，附加8.5g/l琼脂，30g/l 蔗糖，0.6mg/l6-ba和6mg/l naa，培养温度为(25士1)℃，暗培养。

（2）基因遗传转化的方法：农杆菌介导法3.2技术路线培养葡萄果皮愈伤组织↓克隆基因，构建载体↓ 连接转化↙↘侵染愈伤组织 番茄瞬时侵染↓ 对比实验组与对照组，得出结论3.3实验方案3.3.1葡萄愈伤组织的诱导与继代将带柄的葡萄果实流水冲洗2-6小时，在超净工作台内先用无菌水冲洗一遍，再用70%酒精摇洗30s后用无菌水冲洗一遍，随后用0.1% hgcl2消毒8分钟，最后无菌水冲洗3-5遍。

将灭菌消毒后的葡萄去掉果肉，将果皮切成1.5-2.5cm的小片，接种于b5培养基中，25士1℃条件下暗培养。

4. 研究创新点

（1）将转基因技术与植物愈伤组织培养技术相结合，对比分析MADS-box1和SPB-box18基因的作用（2）通过对愈伤组织的侵染和番茄的瞬时表达，阐述MADS-box1和SPB-box18基因在葡萄果实着色成熟中的调控作用。

5. 研究计划与进展

（1）2017.03-2017.04葡萄样品的采集、果皮的分离与保存；（2）2017.04-2017.06建立葡萄果皮愈伤组织；（3）2017.09-2017.12克隆基因，构建载体； （4）2018.03-2018.04 进行愈伤组织的侵染和番茄的瞬时表达；（5）2018.04-2018.05 论文撰写。