梅花WRKY基因家族的分子进化分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1现状分析

梅花早在3000多年前就在中国被驯化为观赏植物和水果（zhang et al.2012）。该种具有突出的装饰特征，如多彩的花冠，令人愉快的香味和各种类型的花（sun et al.2013）。因为它的果实可以被保存或加工成酒和果汁，深受人们的喜爱，具有很大的经济价值。

转录因子（tfs）是重要的调节蛋白，通过与基因的特定dna序列结合从而调节基因表达(brivanlou et al., 2002; yao et al., 2015)。发现这些基因与许多植物信号传导和调控网络相关的应激反应有关( priest et al., 2009; han et al., 2014)。wrky转录因子家族首先在植物中被发现是植物中最大的转录因子家族之一(rushton et al., 2010; wang et al., 2011; okay et al., 2014)，，也是构成许多生物过程的信号网络途径的重要组成部分。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标：

分析梅花中wrky基因家族的结构，功能特征，揭示梅花中wrky基因家族的分子进化过程。

2.2研究内容

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法：

3.1.1 鉴定梅花WRKY基因。

通过从NCBI (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?termPrunus mume)梅花基因组的最新版本（v1）中下载所有蛋白质编码基因的核苷酸和氨基酸序列来在基因组水平上鉴别梅花WRKY，。从PFam数据库（http//pfam.xfam.g/）通过使用HMMER v.3.0（Eddy，1998）搜索隐马尔可夫模型（HMM），获取WRKY结构域（PF03106），E 1e-10。只选择每个基因的最长变体并删除所有其他冗余序列，筛选后，共鉴定出59个含有至少一个WRKY结构域的蛋白质，并将其指定为梅花WRKY基因（PmWRKY）。

3.1.2 梅花WRKY基因的外显子 - 内含子结构

梅花WRKY基因的外显子 - 内含子结构是根据它们的编码序列和它们各自的全长序列的比对来确定的，在基因结构显示服务器（GSDS：http//gsds.cbi.pku.edu.cn/）中，使用从梅花基因组数据（v1）获得的基因模型使基因结构可视化。

3.1.3多序列比对和系统发育分析

使用默认设置的MEGA程序（第7版）比对WRKY基因的氨基酸或核苷酸序列来研究PmWRKY之间的进化关系。为了构建59个WRKY核苷酸序列系统发育树，通过BayBay方法用MrBayes 3.1.2（Ronquist和Huelsenbeck 2003）版对其核苷酸序列的比对。分析四个独立运行，每个运行使用通用时间可逆（GTR）模型加伽马分布率（GTR I G），由模型测试版本3.7（Posada和Crall 1998a）确定。一百万代的马尔可夫链蒙特卡罗模拟运行四个独立的链。总结对树并进行比较以检查拓扑结构的一致性。所有运行中所有兼容分组的共识树用于以下分析。

3.1.4蛋白质性质和保守基序分析

使用ProParam（http//web.expasy.g/protparam）计算PmWRKY的分子量（MW）和等电点（pI）。登陆MEME（http//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgo）对WRKY蛋白中保守基序的进行分析和可视化。使用程序DIVERGE（Gu和Velden 2002）来计算I型功能发散系数θI，II型功能发散系数θII以及任意两个之间的似然比检验统计量组。 可能性检验可以近似为1自由度的χ²分布。

3.1.5分子进化分析

为了研究梅花基因家族间的功能性分歧，利用DIVERGE(GuVelden, 2002)软件计算亚族间的I型功能分歧系数θI，II型功能发散系数θII以及任意两个之间的似然比检验统计量组。。似然比测验统计数近似服从于1个自由度的卡方分布。θI意味着改变了重复基因之间的功能约束。θII表示氨基酸性质的根本变化，但没有改变功能限制(Xun, 2003; Gu, 2006; Yang et al., 2009)。根据后验概率（Qk）预测功能发散贡献的位点，根据经验使用Q（k）≥0.95为临界值。使用各种密码子序列进化模型，使用来自PAML版本4（Yang，2015）的程序代码ml对正选择进行评估。探索了两对模型：单比例模型（M0）和离散模型（M3），以及beta模型（M7）和beta ω模型（M8）。根据Yang等人的研究， 我们使用M0与M3之间的似然比检验（LRT）和M7与M8之间的似然比检验，分别检测了站点间ω的变化。对于χ²统计，M0 / M3测试的自由度为3，M7 / M8测试的自由度为2（Mondragon-PalominoGaut，2005）。如果LRT具有统计显著性，并且基因在群体之下进化，我们运用贝叶斯方法估计测算受到正选择作用的位点。使用具有默认设置的程序GeneConv（Sawyer，1999）对PmWRKY蛋白中的保守基序进行分析。

3.3 实验方案

以梅花为材料，对梅花WRKY基因家族进行了系统的鉴定和分析，包括基因序列、结构、保守基序、进化和组学分析等，进一步去表征了梅花WRKY基因家族的结构，进化和一些功能特征。

3.4可行性分析

①研究工作基础深厚

实验室的课题组老师从事基因克隆及表达量分析等相关分子生物学领域的研究多年，具有丰富的经验，并熟练掌握相关实验技能。该实验室具有基本仪器设备，配套的分子生物学实验室，已具备开展本项目研究所需的仪器和设备。

②研究材料有保障

梅花的相关基因研究在我校早已有人开展，且南京的梅花品种丰富，可为本实验提供大量可靠的实验材料。

③人员配备合理

研究人员具有一定的知识储备和相关实验经验，人员分配合理，相互协作。

4. 研究创新点

1、研究内容创新

首次研究梅花中wrky基因家族的分子进化过程

2、研究技术创新

5. 研究计划与进展

4.1研究计划

2017.62017.9： 梅花中wrky转录因子系统鉴定

2017.92017.12：梅花wrky基因家族的基因序列、结构、保守基序、进化和组学分析等