全文总字数：4064字
1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、本课题的意义
菊花是菊科菊属的多年生草本植物，因其颜色、花型的多样性，成为世界四大切花之一，并且有一定的药用价值和食用价值。近年来，菊花生产面积逐渐增加，已经位居我国鲜花产量前列。但是，由于菊花多用扦插繁殖，病毒对菊花的侵害变得更加容易。各类病毒的侵害会导致菊花生产过程中出现花叶有斑点、生长速度变慢、花朵偏小、花叶萎缩等现象，大大降低菊花的品质和产量，减少菊花经济价值。[1]菊花b病毒（chrysanthemum virus b，cvb）是导致菊花品质下降的主要病毒之一。建立侵染性克隆载体有利于研究菊花b病毒的致病机理，对菊花病害的防控具有重要意义。
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标
（1）以侵染了菊花b病毒的菊花为材料，利用rt-pcr技术进行扩增并测序
（2）快速检测菊花b病毒
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
（1）Trizol法提取带病植株上病毒的总RNA
a.剪去菊花带病植株的叶片100mg，剪碎放进研钵后加少量液氮研磨。研磨后的样品放入1.5ml的离心管中，加1ml Trizol试剂，摇荡15秒后，冰上静置15min；
b.加200μl的氯仿混匀，室温静置2min；
c.4℃条件下，12000g高速离心15min。将上层清液移入新的1.5ml离心管，分层。下层红色酚层，上层水相（含RNA）；
d.加入等体积的异丙醇沉淀RNA，摇匀，静置沉降1h；
e.4℃条件下，12000g高速离心15min；
f.弃上清液，加1ml 75%乙醇，摇匀洗涤2-3次，沉淀，4℃，7000g离心5min；
g.弃上清液，通风干燥，加入适当体积的RNase-free water溶解。
（2）cDNA第一链合成
a.离心管中配置混合液：1μl总RNA，1μl Radom Primer,4μl RNase Free dH2O；
b.70℃保温10min后冰上静置2min，离心；
c.加入反转录反应液
|
上述模板RNA 6μl 5×M-MLV Buffer 2μl dNTPs Mixture(10mM each) 0.5μl RNase Inhibitor(40 U/μl) 0.25μl Rtase M-MLV(RHase H-)（200 U/μl） 0.4μl RNase Free dH2O 0.85μl
d.30℃保温10min，42℃延伸1h，70℃保温15min后冰上冷却。
（3）PCR操作 a.反应体系 ddH2O up to 50μl 2×Phanta Max Buffer 25 dNTP Mix(10 mM each) 1 上游引物（10μM） 2 下游引物（10μM） 2 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 cDNA 1
b.反应程序 循化步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 3min 变性 95℃ 15sec 35 退火 60℃ 15sec 延伸 72℃ 30sec/kb 彻底延伸 72℃ 5min （4）电泳 a.锥形瓶洗净并加入少量纯水煮沸，量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶； b.称取相应量的西班牙琼脂糖倒入锥形瓶，摇匀，用锡纸封口； c.煮胶，过程中适当摇匀，防止爆沸。煮好的凝胶没有气泡、色泽均匀； d.煮好的凝胶转移至65℃水浴锅中，冷却至65℃；冷却后倒入模具凝固； e.转移至4℃冰箱，冷冻30min； f.电泳拍照。 2、技术路线
3、实验方案 （1）采用 Trizol 法提取菊花带病植株上病毒的总RNA； （2）合成第一链cDNA； （3）利用引物设计软件CE Design，自动生成扩增引物；并进行PCR （4）对cDNA进行线性化，对PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列。 （5）得到的PCR产物物与线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，37℃反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。
4、可行性分析 （1）技术可行性 本课题所进行的研究，已经有了比较成熟的实验基础，国内外已有不少的学者对兰花、番茄等不同植物进行病毒侵染性克隆构建。 （2）经济可行性 本实验需要的材料及设备在校内实验室里均已具备，经济上的负担较轻，也锻炼了学生的操作能力。
| |
|
|
4. 研究创新点
本实验涉及的技术均已成熟，也在各种蔬菜、花卉植物上进行过应用。但在对于菊花B病毒在菊花上进行侵染并对其进行快速测定是比较创新的做法。
5. 研究计划与进展
1、研究计划
第一阶段：（2018年3月—5月）
（1）确定研究方向，收集资料，整理资料。
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
