荷花原生质体分离和转化开题报告

全文总字数：4624字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、 课题意义及应用前景

原生质体指植物细胞壁内的原生质，即细胞通过质壁分离，能够和细胞壁分开的细胞物质，包括细胞膜、细胞质和细胞核。原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源dna、质粒、病毒颗粒等外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体；同时，原生质体也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料；还可通过诱导形成杂种细胞，为创造新杂种开辟了途径。原生质体的研究将为基因工程和细胞工程的研究提供广阔的前景。

荷花为睡莲科多年水生草本花卉，中国传统十大名花之一，其叶片和花具有相当高的观赏价值；地下茎莲藕和种子莲子是我国常见的蔬菜，具有很高的经济价值；且荷花的全株均可入药^[1]。目前荷花的转基因研究主要靠荷花的组培体系，但是目前组培体系还不太完善，且生长周期较长。本课题以荷花为材料分离出高质量的原生质体，并尝试建立瞬时表达体系，为今后在荷花的遗传转化、体细胞杂交、再生培养等分子和生理方面的研究奠定了基础，具有重要的意义。

2. 研究的基本内容和问题

一、 研究目标与内容

以荷花叶片为材料，用酶解法分离提取原生质体，探究酶解时间等因素对原生质体产量和活性的影响，找到荷花叶片原生质体分离的最佳条件；然后将带有gfp基因的病毒质粒作为载体，经peg诱导转化，尝试建立瞬时表达体系，为今后的研究奠定基础。

二、 拟解决的关键问题

3. 研究的方法与方案

一、 研究方法

1. 文献研究法：查阅国内外原生质体相关的文献，了解总结原生质体研究的发展现状及不同植物原生质体提取方法的不同；

2. 实验法：根据荷花的生理特性设计实验方案，通过多次实验比较得出适合荷花原生质体分离和转化的条件；

4. 研究创新点

1. 荷花由于其特殊的生理特性，导致细胞层面的研究存在困难。本实验在现有原生质体分离方法的基础上，通过对材料进行一些独特的预处理（如去除表皮等）、增加酶解时间等方法尝试分理处较高产量和活性的荷花原生质体；

2. 原生质体转化时对质粒浓度有要求，一般需要1-2μg/μl，而试剂盒提取的质粒浓度有限，本实验结合碱裂解法提取质粒，质粒浓度可高达5μg/μl，最大限度减少质粒浓度对转化的限制，提高转化效率。

5. 研究计划与进展

本实验预计耗时约一年，研究计划如下：

2018.3-2018.4 选定课题、查阅相关文献、制定实验方案，购买相关试剂及实验器材

2018.5-2018.7 预实验阶段，调整实验方案