枇杷自交亲和品种‘早黄’的分子遗传分析开题报告

全文总字数：8287字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 研究意义：

   自交不亲和是植物进化过程中形成的利于异花授粉，阻止近亲繁殖的一种普遍的遗传控制机制，广泛存在于被子植物中。它可以促使花柱拒绝自身的花粉，从而阻止近亲繁殖，在种群遗传变异的分布上有着很大的作用。在其遗传上受到单一位点(s位点)上的复等位基因（s-allele）控制。近年来，国内外对于苹果属，梨属植物中自交不亲的研究越来越多，也越来越深入，然而，和苹果、梨类似，枇杷作为典型的配子体自交不亲和果树，其研究方向和内容主要倾向于生理方面，在自交不亲和这块的研究资料相对比较缺乏。因此，通过对枇杷s-rnase基因的克隆和自交亲和突变的研究，为进一步开展枇杷自交不亲和的机制研究奠定一定的基础。

   农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它的细胞中分别含有ti质粒和ri质粒，其上有一段t-dna，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将t-dna插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。本课题通过农杆菌介导s₁₀-rnase基因启动子驱动gus基因表达载体转化野生型拟南芥，收获的转基因拟南芥种子为后期研究启动子活性，以此推测启动子功能，为进一步揭示枇杷自交亲和突变机理奠定基础。

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   2. 研究的基本内容和问题

   1、研究目标：

   通过授粉试验，坐果率的统计和荧光显微镜的观察来确定‘早黄’和‘白玉’枇杷中的亲和品种；通过子代分离比的确定来判断自交亲和与s位点上基因的关系；将内含 s10-rnase基因启动子载体的穿刺菌进行活化，导入eha105根癌农杆菌，制备菌液转化拟南芥。

   2、研究内容：

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   3. 研究的方法与方案

   1.研究方法

   1. a 田间授粉实验：在枇杷盛花的11、12月采取露白未开的两个枇杷品种的花蕾，剥下花药，将采取的新鲜花粉，平铺在报纸上，置于24度组培间中，自然散粉12h后，将花粉粒装入离心管后再放入装有硅胶的自封袋中，-20度冰箱保存。选取露白但未开放的花朵，去雄之后，授粉套袋，防止其他花粉污染。自交和杂交授粉朵数为200朵。第二年3月统计坐果率。

      b 荧光测定法：以水溶性苯胺蓝染色，在授粉之后的36,48,72h后剪下柱头用faa固定液处理，荧光显微镜观察花粉管的伸长情况。

      c as-pcr克隆s-rnase基因：ctab 法( pebski,et al., 1997)提取枇杷基因组的dna，用枇杷特异性引物进行as-pcr扩增。

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      4. 研究创新点

      通过田间授粉及荧光显微镜的观察来确定枇杷品种中的自交亲和品种和自交不亲和品种；

      通过坐果率的统计及子代分离比来确定枇杷亲和与S位点上基因的关系；

      通过对启动子活性的研究，探究启动子在自交亲和中可能起到的作用。

      5. 研究计划与进展

      时间安排	计划工作及预期进展
      2018年4月----2018年9月	授粉实验所得实生后代的种植养护
      2018年9月----2018年12月	A 自交和杂交授粉实验 B 野生型拟南芥的种植养护 C 枇杷DNA的提取 D PCR扩增，基因型的鉴定和子代分离比的计算，遗传分析
      2019年3月----2019年4月	A 枇杷坐果率的统计 B 目的农杆菌菌液的制备
      2019年4月----2019年5月	农杆菌花粉管介导拟南芥

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