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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
梨（pyrus）是多年生木本植物，属于蔷薇科（rosaceae）桃亚科（amygdaloideae）梨属（pyrus l.），我国第三大果树树种，有超过三千年的栽培历史[1]。除海南省外，其他各个地区均有梨的栽培，尤其是在我国的河北、安徽及江苏等省份，栽培面积甚广。2016年我国梨生产面积达到112万公顷，年产量1950万吨，占世界总量的71.3%。但是，我国梨果在国外市场的竞争力较弱，出口量和出口价格都远低于日本还有西方其他国家，究其原因主要是由于我国梨品质较低，果肉石细胞含量较高，口感较差。因此，如何提升中国梨果实品质，减少果肉石细胞含量，以满足日益增长的消费者需求，这一问题迫在眉睫。梨果实品质受到多种因素影响，其中石细胞含量是影响梨果实品质的重要因素之一，而木质素的代谢是影响石细胞含量的主要因素。
石细胞是一种具有增厚的次生细胞壁的厚壁细胞，由细胞壁上薄壁细胞二次沉积木质素、纤维素等成分形成[2]。梨果肉中特异积累的石细胞会降低果实品质。目前，已有的梨石细胞研究主要集中在生理学和解剖学这两方面，梨果肉石细胞的形成与木质素的生物合成、转运、积累具有很高相关性[3]；石细胞木质素的组成成分与大部分双子叶植物一致，g-木质素含量大于s-木质素含量，且几乎不存在h-木质素[4]。
木质化是一类复杂的生物合成代谢，而且只存在于高等植物中。其主要功能是增加植物维管组织的机械强度和疏水性，并且在植物抵抗生物胁迫的过程中起到了重要的作用[5]。但植物木质素含量及组成成分的不同，直接影响作物转化为纤维质产物和生物燃料的效率[6-8]。三种木质素单体通过苯丙烷代谢途径合成，经偶联反应聚合形成木质素大分子。从苯丙氨酸到木质素合成过程中，有许多重要的酶参与木质素的合成，例如pal（phenylalanine ammonia-lyase）、c4h（cinnamate 4-hydroxylase）、cse（caffeoyl shikimate esterase）、4cl（p-coumaroyl coenzyme a ligase）、c3h（p-coumarate 3-hydroxylase）、hct（hydroxycinnamoyl-co a shikimate/quinate transferase）、cco aomt（caffeoyl-co a o-methyltransferase）、ccr（cinnamoyl co a reductase）、f5h（ferulate 5-hydroxylase）、comt（caffeic acid o-methyltransferase）、cad（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、lac（laccase）、pod（peroxidase）。最近发现这些酶之间的相互作用对木质素生物合成起到了重要作用。毛果杨中膜蛋白复合体（ptrc4h1/c4h2/c3h3）调节对-香豆酸的羟基化，能通过另外的途径形成咖啡酸[9]。但尚不清楚这一机制在不同物种之间是否保守。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
1利用农杆菌构建表达载体pcambia1301-pbrmyb，在模式材料拟南芥中遗传转化以验证pbrmyb6基因的功能
2降低梨果实的石细胞含量，提高食用品质，进一步提高我国梨的经济价值
3. 研究的方法与方案
研究方法
1.试验材料
本项目使用的材料为白梨系统中的砀山酥梨（P. bretschneideri），含有大量的石细胞、肉质粗糙。自花后21天起，每15天去江苏省高邮果园采集果实样品，第7次取样后待花后150天进行最后一次取样，共8次。每个时期均分别在三棵树上采集样品，做为3次生物学重复。采收的果实应保持大小接近、成熟度相对一致，且无病害、虫害、机械伤害等。采集的部分样品通过液氮速冻置于-80℃超低温冰箱中保存，用于RNA和DNA的提取；剩余样品置于4℃冷库中。
2.RNA和DNA提取
通过CTAB法提取采集样品的DNA和总RNA，提取的样品质量采用分光光度计和琼脂糖胶进行检测。
3.PbrMYB的克隆和生物信息学分析
取3 μg砀山酥梨早期果肉RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesis kit（Transgen, China）进行反转录，表1中为相应引物。PCR产物经过胶纯化回收，连接pEasy（Transgen, China）中间载体并转化到大肠杆菌菌株DH5α中，挑取至少5个单独的克隆用于测序。
表1PbrMYB6克隆引物
Table 1 Primers for cloning PbrMYB6
| 基因缩写Abbreviation | 正向引物Forward (5 to 3) | 反向引物Reverse (5 to 3) |
| PbrMYB6 | GCtctagaATGGGCAGGCAACCTTGT | CGggatccAAGCTCGAAATCTTCAACTCCAA |
注：小写字母为酶切位点，前面是保护碱基。
通过ClustalW软件将PbrMYB编码的氨基酸序列与其他物种已知功能的MYB转录因子进行比对。通过MEGA的Neighbor–Joining方法构建进化树，并通过bootstrap重复检测枝的可靠性1000次；PbrMYB的等电点和蛋白的分子量大小通过Expert Protein Analysis System (http://web.expasy.org/compute_pi/)进行预测。
4.PbrMYB亚细胞定位
将PbrMYB的CDS序列全长构建到GFP上游，形成35S-PbrMYB-GFP融合表达载体。冻融法将测序结果验证正确的质粒和35S-GFP对照质粒转入农杆菌菌株GV3101中。载体通过农杆菌介导转入到烟草表皮细胞中，方法如下：
1、用含有50 mg/L K 和100 mg/L R 的固体LB培养基划线活化农杆菌，在28℃的培养箱中培养36小时；
2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100 mL三角瓶中，加入30 mL含有50 mg/L K 和100 mg/L R 的液体LB培养基，在28℃的摇床中200 rpm培养12小时；
3、用10 mL离心管4000 rpm离心20分钟收集两次菌体；
4、每个离心管中加入2 mL诱导介质（10 mM MgCl2、10 mM MES、200 mM乙酰丁香酮，pH 5.6）重悬后，在小摇床上60 rpm室温诱导3个小时；
5、用去掉针头的注射器将诱导好的液体注射到烟草叶片的背面，置于25℃的培养室，16小时光照/8小时黑暗，培养3-4天。
将烟草叶片剪成1 cm2大小，并用DAPI染色，配方见表2。DAPI能够与DNA强力结合，用紫外光波长的光线激发后，散发光呈蓝色，用于荧光显微镜中定位细胞核。用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察样品，不同样品间保持激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置一致。
表2DAPI试剂
Table 2 DAPI reagent
| 试剂名称 | 终浓度 |
| Tris | 100 mM |
| NaCl | 150 mM |
| CaCl2 | 1 mM |
| MgCl2 | 0.5 mM |
| NonidetP40 | 0.10% |
| DAPI | 1 μg/mL |
注：用HCl调pH到7.4
5.基因表达量分析
取3 μg的RNA通过SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit（Takara, Japan）合成第一链cDNA；LightCycler 480（Roche, USA）进行实时荧光定量PCR。每个基因都分别设置三次生物重复和三次技术重复。2-ΔΔCp算法进行基因的相对表达量的计算。PbrMYB过量表达拟南芥的T2代阳性株系，取种子发芽后第10天的幼苗进行的RNA提取，分析木质素合成相关基因相对表达量的变化。
6.拟南芥转化及生物量测定
将含有PbrMYB6过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染Col-0拟南芥。具体方法如下：
1、在固体LB培养基（50 mg/L K 、100 mg/L R ）上划线活化农杆菌，置于28℃培养箱中，连续培养36小时；
2、线上的单克隆通过灭菌的牙签或枪头挑取出放入100 mL三角瓶中，加入30 mL液体LB培养基（50 mg/L K 、100 mg/L R ），置于28℃摇床中200 rpm培养12小时；
3、培养后的菌液置于50 mL离心管中5000 rpm离心20分钟收集菌体；
4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2 MS；5%蔗糖（W/V）；10 μg/L 6-BA；用KOH调pH到5.7；0.025%表面活性剂（V/V）】中；
5、将拟南芥剪去角果和已开放的花，留下未开花的绿果；
6、处理好的拟南芥花序倒扣在装有有菌体的转化介质的烧杯中（保证花序全部浸泡在介质中），用真空抽滤泵抽真空到380 mm汞柱，保持浸泡5分钟；
7、22℃、避光24小时后，置于22℃、长日照（16小时光照/8小时黑暗）条件的培养室中培养。
取潮霉素抗性的T1代植株，提取DNA，用PbrMYB6特异引物进行PCR扩增，跑胶检测阳性植株。T1代阳性植株生长至两周大后，取花序茎杆提取RNA，半定量检测PbrMYB的表达量。收获T2代纯合子的种子与野生型种子消毒后分别播到含有MS、3%蔗糖、0.75%琼脂的发芽培养基上。然后将幼苗移栽至灭菌营养土中，于22℃、长日照（16小时光照/8小时黑暗）条件的培养室中培养，观察植株的生长情况。
7.转基因拟南芥木质素的分析
野生型和T3代转基因系植株各取10株，采集花序茎下部10 cm长的茎，切段（2 mm），混合样品并烘干至恒重。木质素含量测定用溴乙酰法；通过木质素组成测定用thioacidolysis法；形成的派生物（三甲基硅烷衍生化后）通过GC-MS检测。
8.转基因拟南芥茎组织显微镜观察
8.1石蜡切片
T3代转基因系和野生型植株各随机取五株，用FAA固定液在4℃固定第二节间样品七天后制作石蜡切片，具体步骤如下：
1、脱水：依次用85%、95%、100%、100%乙醇脱水2小时，再用体积比为1：1的无水乙醇和二甲苯脱乙醇2小时；
2、透明：用二甲苯浸泡两次，每次2小时；
3、渗蜡：固定瓶内加入1/2体积二甲苯和1/2体积熔蜡后置于干燥箱中，升温至高于石蜡熔点3℃左右，待石蜡熔化后取盖，2小时后用熔化的纯蜡渗蜡两次，每次2小时；
4、包埋：用高于熔点温度3℃左右的纯蜡溶液将渗蜡过的材料包埋在纸盒里；
5、切片：样品通过Leica RM 2015超微切片机（Leica Mikrosysteme, Germany）切成5 μm厚度；
6、展片：借助毛笔轻轻挑起切下的蜡带，置于35℃水浴锅内展片，待蜡带完全展开后，用载玻片挑起切片，置于37℃培养箱中干燥；
7、脱蜡：将干燥后的材料依次放入纯二甲苯10分钟（重复一次）、无水乙醇4分钟（重复一次）、95%乙醇4分钟、85%乙醇4分钟、70%乙醇2分钟；
8、甲苯胺蓝染色：切片通过1%甲苯胺蓝硼酸溶液染色5分钟，然后依次经95%乙醇处理2分钟，100%乙醇处理两次、每次3分钟（重复一次），二甲苯处理10分钟，二甲苯处理5分钟，用中性树胶盖片，放在37℃培养箱中干燥。
甲苯胺蓝染色切片通过莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察并拍照。木质部宽度通过Image-Pro Plus软件测量。
8.2木质素自发荧光观察
用莱卡TCs SP2光谱共聚焦显微镜观察未染色的切片，二极管激光器发射405 nm激光，不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。
8.3透射电镜
通过2.5%戊二醛固定液4℃下固定与8.1相同的样品12小时，取材应在0-4℃低温下操作，取材的器械和固定液要预冷；取材后应迅速投入新鲜的2.5%戊二醛固定液中；由于固定液的渗透性较差，戊二醛渗透深度为0.5 mm，锇酸的渗透深度为0.25 mm，所以样品大小约为1.5 mm×3 mm，厚度应低于2 mm；若有漂浮在固定液上面的材料，则通过抽气使其完全浸渍于固定液下面以充分固定。然后木质部细胞次生细胞壁的厚度通过Image-Pro Plus软件测量。
9.统计分析
所有的数据均通过SAS软件包统计分析，显著性差异均通过t测验分析，P 0.05 （*），P 0.01 （**）。
技术路线
可行性分析
1.本研究是为验证MYB基因参与梨果实石细胞和木质素合成的功能而提出的，是所在课题组多年来一直从事梨的研究探索和果树分子遗传方面研究基础上形成的。
2.试验材料由南京农业大学园艺学院试验基地提供。试验过程将在南京本地进行，本研究多数为室内试验，不受季节等因素的影响，可利用课余时间、假期进行试验分析。
3.实验室具有从事功能基因组学研究的材料保障、设备条件和技术贮备，承担国家及省部级项目20多项，具有良好的研究基础，实验设备齐全，研究条件良好。
4.个人利用课余时间丰富积累了大量相关知识，同时具有srt项目的研究经验，具有较高的试验操作水平，另外还具备较强的问题分析能力。
4. 研究创新点
研究将有望率先明确MYB基因对梨果实石细胞及木质素合成的作用，获得的重要功能基因将为梨果实的品质性状遗传改良提供理论依据、技术手段和基因资源。
5. 研究计划与进展
2018.2——种植野生型拟南芥
2018.3～2018.4——含有pbrmyb6过量表达载体的农杆菌沾花法侵染拟南芥，成熟后收取种子
2018.5～2018.7——潮霉素筛选获得t1代植株，生根培养并移栽，成熟后收取种子2018.8～2018.10——获得t2代植株，成熟后收取种子，筛选纯合子
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