樟疫霉PcGPIPK2基因的遗传转化研究开题报告

1. 研究目的与意义

樟疫霉属于卵菌门、卵菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属，可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击[1]。据报道，樟疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性[2-3]。在中国，樟疫霉还可以危害雪松，造成雪松疫霉腐烂病[4]。樟疫霉广泛分布于美洲、欧洲以及东亚、南亚和大洋洲等地区，可侵染包括林木以及农作物在内的超过3000多种植物，是森林病害防治的重要病原菌之一[3,5]。为了减少农作物经济损失，我们将对樟疫霉进行分析和研究，筛选出与樟疫霉致病性相关的GPCR-PIPK编码的候选基因，明确其调控的可能信号通路，为新型杀菌剂的研发筛选可能的分子靶标。通过对樟疫霉PcPIPK2基因转录表达谱分析和功能初步分析，可以为疫霉生长发育的研究起到非常重要的参考作用。为新型的杀菌剂研发筛选出可能的分子靶标，有效防治樟疫霉引起的病害，尽可能的减少损失。

2. 国内外研究现状分析

在疫霉的GPCR的编码基因中，有一类基因在N端具有GPCR的七次跨膜结构，同时C端具有激酶的催化活性，其中12个基因在C端具有磷脂酰肌醇磷酸激酶(PIPK)的功能域，这类新型的基因被称为GPCR-PIPK(Bakthavatsalametal.,2006,Kayetal.,2011)。G蛋白偶联受体（GPCR）和磷脂酰肌醇磷酸激酶（PIPK）分别是两类重要的参与不同途径的信号传导通路，对物种的各个生长发育阶段都起着非常重要的调控作用。目前GPCR-PIPK只在卵菌和盘基网柄菌中有发现(Riyahietal.,2011)。在盘基网柄菌中，只有一个编码GPCR-PIPK的基因RpkA，在感知细胞的密度和抗细菌的防卫系统中发挥作用。RpkA缺失突变体不能感受细胞密度的信号，从而不能产生自动聚集的效应。RpkA的信号是通过G蛋白a亚基-Ga1将信号传导到下游；用GPCR部分的功能区域就可以回补RpkA缺失突变体所丧失功能，这些都可以说明RpkA的主要功能为GPCR这段区域，而PIPK区域却并没有实际的功能。但RpkA结合的配体仍然未知(Bakthavatsalametal.,2007)。与传统的GPCR不同，RpkA并不定位在细胞膜上，而是定位在细胞质中的小囊泡上。PIPK激酶利用PIPK磷酸化磷脂酰肌醇一磷酸异构体（PIP）产生生成磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），两者都能够在多种途径中作为第二信使(Doughmanetal.,2003,McLaughlinMurray,2005)。这种GPCR的功能域与PIPK的独特结合可能跟其行使的独特的作用有关，成为良好的研究对象。而在疫霉中存在的GPCR-PIPK编码基因可能使疫霉存在一条和别的物种不同的信号传导通路。GPCR-PIPK可能存在三种功能，分别是G蛋白偶联受体的功能、磷脂激酶的功能或者蛋白激酶的功能。外源的信号结合GPCR-PIPK蛋白后，通过GPCR结构域而将信号直接传递到PIPK功能结构域，进而绕过G蛋白而将信号传递到下游，并调控疫霉的生长发育等一系列过程。Yang等（Yangetal.,2013）发现PsGK4调控大豆疫霉的游动孢子的趋化性、休止率、萌发率和趋化性等一系列表型。PsGK5影响了卵孢子的产生，外源添加性激素也不能恢复卵孢子的产生，在有性生殖过程中发挥着作用。将两个基因融合红色荧光蛋白以后进行定位研究，发现两个基因有着相似的定位，均定位在细胞质的小囊泡结构上，并能够在细胞质中快速的移动，没有发现在细胞膜上的定位。致病疫霉中PiGK4调控致病疫霉的孢子囊的产生和致病性

3. 研究的基本内容与计划

4、研究内容及计划

3.1研究内容

（1）樟疫霉致病性相关新型gpcr-pipk候选编码基因的结构预测与生活史转录表达模式分析

4. 研究创新点

（1）转录表达模式分析gpcr-pipk家族对樟疫霉菌潜在的调控信息

（2）利用瞬时转化体系和稳定转化体系相结合快速分析致病性相关新型gpcr-pipk候选基因的功能