农杆菌介导大豆炭疽菌转化体系的构建及优化开题报告

1. 研究目的与意义

大豆是我国主要的油料作物之一，也是植物蛋白的重要来源，但是受到进口转基因大豆的影响，种植面积正不断减少，我国大豆面临严重的产业危机。

又由于其产量和品质受到平头炭疽菌病害的影响很大，而且对它的致病机理不清楚，且关于该菌生长发育和致病相关基因克隆的报道一片空白，因此研究其致病机理，有效防治平头炭疽菌引起的病害对大豆产业生产是很有必要的。

炭疽病是大豆的一种重要病害，其致病菌是平头炭疽菌[1]。

2. 国内外研究现状分析

国内：河北农业大学的钟鸣，黄国涛，白丽萍对农杆菌介导法的植物转基因载体进行了研究，研究表明农杆菌菌株的活性在整个体系中有着至关重要的作用[5]。

沈阳农业大学的孙佳莹对玉米北方炭疽病菌生物学特性进行了研究，研究表明农杆菌介导的转化效率主要与二个因素有关,一是外植体的的再生能力，二是农杆菌的侵染效率[6]。

安徽农业大学的储韬对农杆菌介导黄曲霉菌遗传转化进行了研究，研究表明利用黄曲霉的分生孢子作为农杆菌介导的受体细胞能够更加便捷的进行黄曲霉的遗传转化，且分生孢子作为单个的细胞也更有利于后期转化子的筛选及稳定性遗传研究。

3. 研究的基本内容与计划

1 研究内容利用根癌农杆菌侵染受伤植物时,可将其质粒上的一段整合到受体植物基因组中,并能够稳定地在植物体内进行遗传表达。

用农杆菌介导转化平头炭疽菌分生孢子，以潮霉素b为筛选标记，并将外源基因绿色荧光蛋白基因导入平头炭疽菌基因组，对抗性稳定及荧光表达稳定的转化子进行pcr检测，构建平头炭疽菌atmt突变体库；从突变体库中随机选取一定数量的突变体，从正向遗传学角度对突变体的菌落形态、菌丝显微观察、生理生化、致病性等进行分析，为探索控制表型、性状的基因提供丰富的材料。

2 研究计划（1）筛选平头炭疽菌的最佳产孢培养基，以收集大量的分生孢子供农杆菌介导转化；（2）摸索优化农杆菌浓度、农杆菌与分生孢子的混合比例、共培养时间等遗传转化条件；（3）建立稳定且高效的根癌农杆菌介导的平头炭疽菌遗传转化体系；（4）用荧光显微镜和pcr筛选绿色荧光蛋白强表达和具潮霉素抗性的阳性转化子；（5）用荧光菌株观察平头炭疽菌侵染大豆叶片的过程；（6）准备答辩，完善、提交论文定稿。

4. 研究创新点

一、转化的受体多样。

在农杆菌介导的丝状真菌遗传转化中，不局限于使用原生质体作为转化受体，分生孢子、菌丝等也可作为受材料。

二、转化效率高。