1. 研究目的与意义

目的意义

1.1 背景及意义

樟疫霉（phytophthora cinnamomi）又称褐疫霉、肉桂疫霉，属于卵菌门(oomycota)、卵菌纲(oomycetes)、霜霉目(peronosporales)、腐霉科(pythia-ceae)、疫霉属(phytophthora)，可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击^[6]。广泛分布于欧洲、美洲、东亚、南亚及大洋洲等地区，其寄主广泛，包括樟属植物在内的超过 3000 多种林木和农作物等^[5]。

基因组序列分析表明，疫霉菌编码数目庞大的效应因子。根据效应因子在植物中靶标位置的不同可将其分为两类：质外体效应分子( apoplasticeffectors)和胞内效应分子( cytoplasmiceffectors)。胞内效应因子主要包括 rxlr(r:精氨酸x:任意氨基酸l:亮氨酸)和 crn(crinkling and necrosis inducing protein)两类^【23】。在致病疫霉菌中crn效应因子具有诱导植物叶片皱缩和细胞死亡的活性，已经明确植物病原卵菌 rxlr 效应分子功能具有多样性、冗余性等特点。

将候选基因构建到pvx载体上，转化农杆菌得到转化子，验证阳性克隆，然后将含有候选效应分子基因avh87和bax的农杆菌菌悬液注射烟草，观察效应分子是否能抑制bax引起的烟草细胞死亡；将重组质粒转化农杆菌gv3101，挑取单个农杆菌菌落在lb培养液中培养2d后用10mm的mgcl₂洗涤并重悬菌液，使菌体浓度达到od₆₀₀=0.3，接种烟草叶片，从第5d开始记录注射点的坏死情况；在进行抑制细胞坏死效应分子筛选的同时，将候选rxlr基因avh29单独注射到烟草叶片上，检查其能否引起hr反应。同时采用rt-pcr的方法检测效应分子基因在樟疫霉生活史各阶段的转录水平。本研究以bax诱导的hr作为一个选择性标记，通过基于pvx病毒载体在烟草细胞内表达樟疫霉的rxlr效应蛋白，筛选能够抑制bax诱发的细胞死亡的效应蛋白，希望为rxlr蛋白在大豆疫霉致病过程中的作用提供证据。

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2. 国内外研究现状分析

植物病原卵菌效应分子的研究进展

卵菌与真菌在形态上类似,但在进化关系上较远，其生物学特征主要表现为细胞壁大多由纤维素构成、营养生长阶段为二倍体、线粒体脊为管状等。植物病原卵茵包括致病疫霉、大豆疫霉、橡树疫霉以及樟疫霉、拟南芥霜霉等,目前上述卵菌的全基因组序列均已正式公布，其与寄主之间的相互作用基本符合zigzag理论。该理论认为,病原菌为了操控寄主植物防卫反应，分泌和转运一些效应分子进入植物细胞中,从而抑制pti,同时,植物中识别病原菌效应分子的防卫基因得到激活,引发et1,随着病原茵与植物的互作类似于军备竞赛的不断升级,植物和病原菌在遗传上实现协同进化^[8]。

1. rxlr效应分子的研究进展

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3. 研究的基本内容与计划

研究内容及计划

3.1 研究内容

3.1.1 供试烟草及供试菌株的培养，LB培养基制备

供试本氏烟(Nicotiana benthamiana)为本实验室培育。烟草苗的培育参照Zhang等(2004)的方法，待烟苗长至5叶时供试验用。樟疫霉菌株由本实验室保存。

LB培养基

1.胰蛋白胨 8g NaCl 8g 酵母提取物 4g(800ml量)偏分子方向 16g 800ml蒸馏水；

2.放琼脂前调pH至7.1-7.3

3.高压灭菌，在温度降下来前加好抗生素

4.倒板:一般15ml-20ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

5.保存:用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

3.1.2 菌丝的培养及菌丝粉的制备

将用于筛选和对照的菌株均接种在V8培养基中然后将其放入25℃的恒温箱中进行培养，时间视菌株实际情况而定，一般为3 - 4 d，并且在整个试验中做对菌株进行不定期的活化。然后从菌落的边缘切取11 mm的10小块菌丝块，将其转至V8液体培养基中^[9]，同样放入25℃的恒温箱中进行水培3 - 4 d。最后用液氮将过滤收集的菌丝研磨成菌丝粉，放入离心管并至-20℃的冰箱中进行保存备用。在此所有环节中要保证在无菌的条件下进行。

V8的制备：100毫升V8果汁加入1gCaCo3后，离心机2500rpm离心五分钟，上清液与蒸馏水1:9比例稀释即为10%V8培养液。配置固体培养基则每1L添加15g琼脂粉。121℃高压灭菌20分钟。

3.1.3樟疫霉菌丝基因组DNA的提取1、将在Vg液体培养基中培养48h的菌丝，使用滤纸片将菌丝水分吸干，放于盛有液氮的研钵中，研碎，获得菌丝粉；

2、取少量菌丝粉于已灭菌的EP管中，加入900μL2%CTAB提取液和90μL10%SDS，涡旋混匀，于60℃水浴1h，期间每隔10min上下颠倒几次，12000rpm离心10min；

3、吸取上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，颠倒混匀，12000rpm离心5min；

4、将上清液转移至新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min；

5、将上清液转移至新的EP管中，加入2倍于上清体积的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc(醋酸钠)(pH=5.2),-20C沉淀多于lh；

6、12000rpm离心5min舍弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温晾干；7、加适量灭菌超纯水溶解沉淀(含20μg/mLRNase),37℃消解1h后，-20℃保存备用。3.1.4效应分子基因克隆及重组质粒的构建引物设计原则:除遵循一般引物设计原则外,为保证效应分子基因能够在烟草细胞质内稳定的表达并行使功能，上游引物序列设计依据去掉信号肽后的效应分子基因序列进行，从而能够保证后续研究中基因表达产物不被分泌到烟草细胞外。

效应分子的基因克隆：以樟疫霉基因组DNA为模板，根据去信号肽效应分子基因序列所设计的引物，设置不同的退火温度及延伸温度、时间，进行高保真PCR扩增[所用高保真酶为PrimerSTARTMHSDNAPolymerase(TaKaRa)].具体反应程序为:98℃30s，68℃30s，72℃45s-1min(根据基因的延伸速率1kb/min及基因大小来确定)，一般扩增30个循环。将PCR产物经过凝胶试剂盒[AgaroseGelDNAPurificationKit(TaKaRa)]回收纯化后，根据前期所设计的酶切位点采用相应的酶进行酶切。

将所有经高保真酶PCR扩增得到的回收产物经过酶切后连接到相应酶切位点的pGR106载体中，转化大肠杆菌(E.coli)JM109，待长出菌落之后，利用菌落PCR方法验证转化子。菌落PCR验证引物根据PVX载体多克隆位点两侧序列设计，上游引物(PVXF):5'-CAATCACAGTGTTGGCTTGC-3'，下游引物(PVXR)：5'-GACCCTATGGGCTGTGTTG-3',验证程序为:94℃预变性3min，94℃30s，56℃30s，72℃1min,32个循环。提取阳性克隆的质粒酶切验证，并将已验证的大肠杆菌转化子进行测序。3.1.5农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化3.1.5.1农杆菌感受态细胞的制备1、将冻存于-70C超低温冰箱中的农杆菌GV3101的甘油菌，在LB[1%蛋白胨(tryptone)、0.5%酵母提取物(yeastextract)、1%氯化钠(NaCl)、1%琼脂粉(agrose),121℃灭菌20min]平板上划线,置于28℃培养箱中黑暗培养2d,用灭菌牙签挑取新鲜的单菌落于盛有5mLLB液体培养基的试管中，在摇床上28℃、200rpm振荡培养2d；

2、将培养好的农杆菌以1:100的比例置于含有300mLLB[1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠，121℃灭菌20min]液体中，28℃振荡至OD_6OO达0.3-0.4,分装于50mL离心管中，配平，于4℃离心机3500rpm离心10min；

3、弃上清，用预先置于-20℃冰柜中的灭菌超纯水10mL重新悬浮，重悬尽量保证无小块沉淀，并用移液器吸打均匀，配平，于4℃离心机3500rpm/min离心10min；

4、将步骤3重复三次；

5、弃上清，每个离心管中加入2mL15%的甘油(已灭菌),使用移液器吸打菌液，并收集于1.5mLEP管中。

6、将所收集的菌液在冰上快速分装于若干个冷的1.5mLEP管(预先置于-20℃冰柜)中，每管50L细胞液；

7、液氮速冻，于-70C冰箱保存备用。

3.1.5.2农杆菌转化农杆菌感受态细胞

操作方法

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于干冰上或室温融化

2.每100微升感受态加1微升质粒DNA混匀，依次于干冰上静置10min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min。

3.加入700微升无抗生素的YEP或LB液体培养基，于28℃震荡培养2-3小时。

4.5000rpm离心一分钟收集菌体，留取100微升左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的YEP或LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

5.根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的YEP或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于28℃直至液体被吸收，倒置培养，28摄氏度2-3天

注意事项1.感受态细胞一定要用干冰运输，感受态细胞应在-80℃下保存，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化率2.转化的所有步骤均在无菌条件下执行。3.感受态细胞最好在冰上融化。4.混入质粒时应轻柔操作5.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.1.6筛选抑制Bax引发HR的效应分子将经过测序验证正确的携带有效应分子基因(pGR106::effectors)的重组质粒转化农杆菌GV3101,挑取重组的农杆菌单菌落，置于3mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养液中，28℃、转速为200rpm的摇床中振荡培养2d，4000rpm离心5min收集菌体，用10mM的MgCl₂洗涤上述菌体3次，然后用适量的MgCl₂溶液悬浮菌体，使菌体悬浮液OD₆₀₀值达到0.3。用1mL的去针头的注射器将该细菌悬浮液从本氏烟叶片下表皮注射渗透接种到生长期为4-5周左右的烟草叶片中(Boset al.2006)。注射烟草叶片以GFP(pGR106::GFP)的农杆菌作为阴性对照，每个效应分子设三个处理，分别是:1、将含效应分子的农杆菌菌悬液与含Bax(pGR106::Bax)的农杆菌菌悬液同时注射；2、先注射效应分子，12h后注射Bax；3、先注射效应分子，24h后注射Bax。

通过前期所设置的时间处理试验，结合预试验结果，采取处于12h至24h之间的16h进行试验的重复验证，即将效应分子所表达的时间调换为16h,再注射Bax。（图三）

图3抑制Bax 引发HR的效应分子筛选策略及表型统计类型

A 图为抑制Bax引发HR的效应分子筛选策略; B 图为表型统计类型分别为注射效应分子0、12、24h 后再注射Bax,黑色代表为产生HR 区域，白色代表为未产生HR 区域。

Fig.3 Schematic representation of method with screening on effector inhibition HR induced by Bax.

A,B figure was screening methods on effector of inhibiting HR trigged by Bax,and phenotype ofresponse,respectively.

3.1.7抑制PAMP(INF1)引发HR的效应分子筛选

经过前期所设置的时间处理试验，结合预试验结果，采取处于12h至24h之间的16h进行后续筛选试验（图四）。将含有候选效应分子基因和Bax的农杆菌菌悬液注射烟草，观察效应分子是否能抑制Bax引起的烟草细胞死亡；将重组质粒转化农杆菌GV3101，挑取单个农杆菌菌落在LB培养液中培养2d后用10mM的MgCl₂洗涤并重悬菌液，使菌体浓度达到OD₆₀₀=0.3，接种烟草叶片，从第5d开始记录注射点的坏死情况；在进行抑制细胞坏死效应分子筛选的同时，将候选RXLR基因单独注射到烟草叶片上，检查其能否引起HR反应。（图五）

图4农杆菌注射本氏烟示意图及统计图

当效应分子在本氏烟上表达16 h 后，再在表达效应分子的位置注射包括Bax 或者效应分子Avh87或者INF1,同时以表达GFP 为阴性对照。

Fig.1-3 Schematic representation of using Agrobacterium tumefaciens infiltration assay

The diagram illustrates the scheme in the infiltration in N.benthamiana.Agro-infiltration sites

expressing ither 50 putative effectors or △GFP（vector control）were challenged with A.tumefaciensexpressing the BAX or Elicitor(including Avh238,Avh241and INF1elicitin) in N.benthamiana after16hours.

图4樟疫霉RXLR效应蛋白筛选策略

3.2 实验进程安排

4. 研究创新点

对植物病原卵菌基因组序列进行生物信息学分析及功能预测，并结合生物学试验的进一步验证，极大地推动了对效应基因的研究工作。 目前 ，对卵菌基因功能研究多采用干扰基因表达、缺失特定基因以及促使基因表达等方法。随着 对卵菌研究技术的不断完善和创新，今后开展效应基因功能对研究将更加快捷、有效，同时，一些危害农林业经济生产重要的植物病原卵菌橡树疫霉(P．ramorum)、樟疫霉 (P．cinnamom)、辣椒疫霉(P．capsici)全基因组测序工作的逐渐完成，对其RxLR效应基因开展功能研究，为进一步明确其具有的抑制 BTPCD、抑制PTI、ETI功能以及诱导细胞死亡、协同作用调控植物防卫反应等功能提供更多的试验数据。